ATP敏感的線粒體鉀通道開放劑介導(dǎo)延遲預(yù)處理的機(jī)制研究.pdf

1、自1950年Bigelow第一次在心臟手術(shù)中引入心肌保護(hù)的概念后,隨著不斷成熟的低溫體外循環(huán)技術(shù)及心肌灌注停跳液的改進(jìn),使手術(shù)中的心肌保護(hù)已經(jīng)取得了巨大的進(jìn)步.然而這些都遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒達(dá)到我們預(yù)期的效果,尤其在嬰幼兒心臟手術(shù)中,由于大部分先天性心臟病患兒的心肌術(shù)前處于紫紺缺氧狀態(tài),易受到傷害,這個(gè)問題就更為突出<'[2]>. 缺血預(yù)處理(Ischemic Preconditioning,IPC)是指短期缺血應(yīng)激使機(jī)體組織對隨后的更長時(shí)間缺血再灌

2、注損傷產(chǎn)生明顯保護(hù)作用的一種適應(yīng)性機(jī)制.它是由1986年由Murry及其合作者發(fā)現(xiàn)的,目前IPC已經(jīng)公認(rèn)的目前最強(qiáng)的內(nèi)源性心肌保護(hù)措施,但是其確切機(jī)制仍未明確<'[2]>.缺血預(yù)處理分為兩個(gè)階段,即刻出現(xiàn)為典型缺血預(yù)處理階段,只能持續(xù)2～3小時(shí);12～24小時(shí)后,進(jìn)入延遲預(yù)處理階段.延遲預(yù)處理可以持續(xù)3～4天.因此延遲預(yù)處理具有更大的臨床應(yīng)用價(jià)值. 由于對于缺血預(yù)處理講要想獲得這種心肌自身內(nèi)在的抗損傷機(jī)制,必須先以接受缺血預(yù)適應(yīng)

3、的損傷為代價(jià).到目前為止,缺血預(yù)適應(yīng)在心臟外科并未得到廣泛的應(yīng)用,因此許多學(xué)者提出用藥物模擬缺血預(yù)處理.藥物預(yù)處理的研究最初是通過對缺血預(yù)處理保護(hù)機(jī)制的理解,利用能夠激動IPC信號傳導(dǎo)某一階段的藥物模擬其作用.現(xiàn)已經(jīng)證實(shí)的低劑量亦具有誘導(dǎo)心臟保護(hù)的藥物包括線粒體鉀通道(ATP-sensitive potassium channel,mitoKATP)開放劑、吸入性麻醉藥和阿片類麻醉藥、腺苷等. 本實(shí)驗(yàn)從新生鼠中分離出心肌細(xì)胞,以

4、缺氧/無血清(Hypoxia/SD)模型模擬體內(nèi)養(yǎng)分匱乏和低氧的缺血微環(huán)境,建立未成熟心肌的體外缺氧的細(xì)胞膜型<'[5]>,研究在此條件下mitoKATP開放劑DZX介導(dǎo)的延遲預(yù)處理對心肌的保護(hù)作用.并且觀察吡咯烷二硫基甲酸鹽(Pyrrolidinecarbodithioate,PDTC)作為NFκB的特異拮抗劑<'[6]>,是否能較為完全的阻斷DZX介導(dǎo)延遲預(yù)處理的心肌保護(hù)作用.并初步探究討其機(jī)制,力圖為DZX最終在未成熟心肌保護(hù)的臨

5、床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù). 目的 體外模擬機(jī)體缺血缺氧環(huán)境,觀察DZX介導(dǎo)的延遲預(yù)處理對心肌的保護(hù)作用,并證明mitoKATP開放后進(jìn)一步激活NF-κB,從而促進(jìn)各種保護(hù)基因的表達(dá)而產(chǎn)生對心肌的保護(hù)作用.為DZX在未成熟心肌保護(hù)的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù). 方法 1.分離培養(yǎng)出生1～3天的SD(Spragde DaWley)大鼠的心肌細(xì)胞待用<[7]>. 2.將乳鼠的心肌細(xì)胞隨機(jī)分為缺氧組、DZX組、DZX

6、+PDTC組和對照組. 3.DZX組于細(xì)胞缺氧培養(yǎng)前24小時(shí)放入含100μmol/L的DZX的培養(yǎng)液15分鐘;DZX+PDTC組于細(xì)胞缺氧培養(yǎng)前24小時(shí)放入含100μmol/LDZX和500μmol/L PDTC的培養(yǎng)液15分鐘;對照組及缺氧組則放入含空白溶劑的培養(yǎng)液15分鐘. 4.用缺氧袋、缺氧罐和無血清培養(yǎng)液建立Hypoxia/SD模型模擬體內(nèi)的缺血缺氧環(huán)境<'[5]>,將缺氧組、DZX組、DZX+PDTC組心肌細(xì)胞

7、放進(jìn)行無氧培養(yǎng)16小時(shí),繼之2小時(shí)的有氧培養(yǎng).對照組則一直有氧培養(yǎng). 5.檢測各項(xiàng)指標(biāo):Hoechst染色,Annexin V/PI流式檢測凋亡細(xì)胞,WesternBlot檢測心肌細(xì)胞Bax和Bcl-2的表達(dá),生色底物法檢測Caspase-3酶活性. 結(jié)果 1.與對照組比較缺氧組明顯出現(xiàn)大量心肌細(xì)胞凋亡,尤以早期凋亡最為明顯,Annexin V/PI法流式檢測、Hoechst染色、Caspase-3酶活力的測定均

8、支持這一結(jié)果. 2.與缺氧組比較DZX組能明顯的抑制Hypoxia/SD誘導(dǎo)的乳鼠心肌細(xì)胞凋亡,流式檢測細(xì)胞凋亡降低明顯.Hoechst染色、Caspase-3酶活力的測定也都說明DZX組乳鼠心肌細(xì)胞凋亡減少. 3.與DZX組比較DZX+PDTC組乳鼠心肌細(xì)胞凋亡明顯增多,提示NF-kB是DZX介導(dǎo)的延遲預(yù)處理機(jī)制的下游關(guān)鍵通路. 4.Western blot檢測顯示DZX組與DZX+PDTC組、缺氧組比較Bcl

9、-2表達(dá)增加,Bax表達(dá)減少,Bcl-2/Bax比值升高明顯,提示DZX介導(dǎo)的延遲預(yù)處理機(jī)制與Bcl-2和Bax調(diào)控相關(guān). 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)建立Hypoxia/SD模型能成功的模擬機(jī)體缺血缺氧環(huán)境.在體外細(xì)胞試驗(yàn)中,mitoKATP開放劑DZX介導(dǎo)的延遲預(yù)處理對心肌的有明顯的保護(hù)作用.而位于mitoKATP下游的NF-kB的激活則在未成熟心肌的延遲預(yù)處理中起著關(guān)鍵作用.此外NF-KB通過調(diào)控促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的表