高遷移率族蛋白B1對成骨細胞遷移和增殖的影響及其作用機制.pdf

1、目的：
　　1.研究HMGB1對大鼠成骨細胞增殖及遷移的影響:重組HMGB1對體外培養(yǎng)的大鼠成骨細胞增殖以及遷移能力的影響及規(guī)律。
　　2.研究HMGB1影響成骨細胞遷移的分子機制:通過利用小干擾RNA干擾技術研究toll樣受體2(TLR2)及toll樣受體4(TLR4)在成骨細胞遷移過程中的作用及對相關轉錄因子核因子-κB(NF-κB)的活化影響，確定其作用途徑和分子機制。
　　方法：
　　1.材料和試劑:SD

2、大鼠成骨細胞購自中國天津威凱生物公司;胎牛血清，胰酶及DMEM培養(yǎng)液;四甲基偶氮唑藍(MTT)和二甲基亞砜(DMSO);Trizol及Turbofect轉染試劑;逆轉錄試劑盒及PCR試劑盒;NE-PER胞核胞漿提取試劑盒;rhHMGB1;TLR2，TLR4，NF-κB p65及GAPDH的抗體。
　　2.細胞培養(yǎng):將成骨細胞以每孔2×105個接種于六孔板，用含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)于37℃，5％ CO2的孵箱中，每兩天

3、更換一次培養(yǎng)液，將細胞分為空白對照組，TLR2-siRNA轉染組和TLR4-siRNA轉染組。
　　3.TLR2及TLR4 siRNAs的設計及轉染:設計合成三對針對TLR2，TLR4的siRNA，以與人類基因無同源性的siRNA作為陰性對照（siRNA序列見正文）;將成骨細胞培養(yǎng)至70-80％融合時，吸去舊的培養(yǎng)基，用PBS輕洗2次，每孔加入1.6ml無血清培養(yǎng)基，置于5％ CO2、37℃培養(yǎng)箱中;取濃度為20μM的siRNA/

4、microRNA2μl,加入400μl無血清培養(yǎng)基中，混勻后，加入4μl TurbofectsiRNA轉染試劑，混勻后在室溫下孵育15-20min;每孔加入上述孵育好的轉染復合液400μl，置于5％ CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4-6h后換成正常的完全培養(yǎng)基，轉染后24-48h，檢測mRNA及蛋白表達水平。
　　4.RT-PCR: siRNA轉染24h后收集細胞，按照Trizol說明書進行細胞總RNA提取，反轉錄合成cDNA。后以c

5、DNA為模板，進行PCR擴增（引物序列見正文）。反應條件為95℃10min;然后95℃15s，60℃30s，72℃15s，95℃15s，共40個循環(huán);然后60℃1min，95℃15s。繪制熔解曲線及標準曲線，以GAPDH為內(nèi)參，通過ΔΔCT方法分析基因的表達結果。至少重復進行三次單獨的實驗。
　　5.Western印跡法及蛋白細胞漿細胞核抽提技術:siRNA轉染24h后收集細胞，提取細胞總蛋白，采用BCA法進行蛋白定量;采用細胞核

6、及細胞漿提取試劑盒提取NF-κB p65胞核和胞漿蛋白，Lamin B1和GAPDH分別作為胞核和胞漿內(nèi)參，采用BCA法進行蛋白定量。取等量蛋白40μg上樣，進行10％十二烷基硫酸鈉-聚丙烯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，濃縮膠80V，分離膠120V恒壓電泳，350mA恒流轉膜1h。然后用5％脫脂奶粉的TBST液中封閉2h，加入抗TLR2，TLR4及GAPDH抗體4℃孵育過夜，次日室溫孵育1h后TBST洗膜10 min3次，用辣根過氧化

7、物酶標記的多克隆山羊抗兔IgG孵育1h，TBST洗膜10 min3次，增強型化學發(fā)光試劑(ECL)顯色，X膠片曝光，采集圖像。采用Uvipro凝膠成像系統(tǒng)掃描膠片，IPP6.0軟件分析光密度值，以目的蛋白和相應內(nèi)參條帶的光密度比值表示目的蛋白的表達水平。
　　6.細胞增殖測定:采用MTT法檢測細胞增殖情況，取不同組成骨細胞按5×103個/mL接種至96孔板，每孔200μl，設置3個復孔，置于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1-3d，

8、在培養(yǎng)結束前4h每孔加入20μl MTT溶液，然后培養(yǎng)結束后棄去培養(yǎng)液，每孔加入150μl DMSO，震蕩10min，酶標儀檢測492 nm處的吸光值。
　　7.細胞遷移測定:采用Boyden Transwell小室法(24孔微孔聚碳酸酯膜，孔直徑8.0μm，膜厚度6.5 mm)進行細胞遷移檢測，將細胞密度調(diào)整為1×105個/mL經(jīng)不同處理后的成骨細胞100μl加入上室中，下室加入500μl含15％FBS的DMEM培養(yǎng)液，置于37

9、℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h后，棄去培養(yǎng)液，用棉簽擦去上室內(nèi)未遷移的細胞，95％酒精常溫固定30min，結晶紫染色20min，PBS清洗，在顯微鏡10倍視野下觀察，每一樣本隨機選取4-5個視野，計數(shù)每個視野下染色細胞數(shù)量，取其平均值。
　　統(tǒng)計分析：
　　應用SPSS18.0進行統(tǒng)計分析，數(shù)值變量資料以均數(shù)±標準差（M±SD）表示，每組實驗重復三次，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05被認為差異有統(tǒng)計學意義。
　

10、　結果：
　　1.HMGB1促進成骨細胞遷移，同時不影響成骨細胞增殖
　　我們利用Boyden Transwell小室法檢測細胞的遷移能力，利用MTT法檢測細胞的增殖能力。將細胞培養(yǎng)液中分別加入濃度為0，50，100，150，200μg/L的重組人HMGB1，進行培養(yǎng)24h后，將各組細胞加入Transwell小室的上層中，進行遷移實驗。結果發(fā)現(xiàn)遷移4h后，大量的成骨細胞轉移到下層，通過計數(shù)發(fā)現(xiàn)HMGB1可促進成骨細胞遷移，并

11、呈濃度依賴性，在濃度為150μg/l時細胞遷移能力最強，為對照組的2倍(p＜0.05)。選擇該濃度進行下一步實驗。MTT法顯示不同濃度HMGB1刺激下細胞的增殖能力無明顯改變。
　　2.siRNA轉染可有效抑制成骨細胞TLR2，TLR4的mRNA及蛋白表達水平
　　通過RT-PCR及Western印記法檢測轉染24h后成骨細胞TLR2，TLR4的mRNA及蛋白表達水平。結果表明3組針對TLR2及TLR4的siRNA都能有效沉

12、默相應受體mRNA及蛋白的表達(p＜0.05);其中TLR2-siRNA392，TLR4-siRNA703組與空白對照組相比，TLR2及TLR4的mRNA表達水平分別下調(diào)了94％和84％，蛋白表達水平分別下調(diào)了52％和35％(p＜0.05)。因此后續(xù)實驗選用TLR2-siRNA392，TLR4-siRNA703進行基因轉染。
　　3.HMGB1通過TLR2或TLR4誘導成骨細胞NF-κB的活化
　　選擇沉默效率最高的TLR2

13、-siRNA392，TLR4-siRNA703進行轉染后，將細胞分為3組，分別為對照組， TLR2-siRNA組， TLR4-siRNA組，通過胞漿胞核提取技術及Western印跡法檢測各組細胞在受到重組人HMGB1刺激前后細胞核內(nèi)外NF-κB p65的含量。當對照組成骨細胞受到HMGB1刺激后，細胞核內(nèi)NF-κB p65明顯升高，但利用TLR2-siRNA及TLR4-siRNA轉染細胞后，細胞TLR2及TLR4表達下降后，在同樣重組H

14、MGB1刺激下，細胞核內(nèi)NF-κB p65增加的含量較未轉染組降低，降至對照組的47％和75％(p＜0.05)。
　　4.HMGB1通過TLR2或TLR4誘導成骨細胞的遷移
　　選擇沉默效率最高的TLR2-siRNA392，TLR4-siRNA703轉染后，將細胞分為3組，分別為對照組，TLR2-siRNA組， TLR4-siRNA組，檢測各組細胞在受到重組人HMGB1刺激前后改變的遷移數(shù)量。實驗發(fā)現(xiàn)對照組成骨細胞受到重組人

15、HMGB1（150μg/l）刺激后，細胞遷移能力增加了2倍(P＜0.05)，但TLR2-siRNA組及TLR4-siRNA組在相同濃度的HMGB1刺激下，增加的細胞遷移數(shù)量較對照組明顯降低(P＜0.01)。說明TLR2/TLR4參與了HMGB1誘導的成骨細胞遷移。
　　結論：
　　在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)重組人HMGB1可促進大鼠成骨細胞遷移，大鼠成骨細胞在受到重組人HMGB1刺激后，通過Transwell實驗發(fā)現(xiàn)細胞遷移能力較

16、對照組增加了2.3倍，MTT實驗顯示細胞的增殖能力未受到明顯影響。成骨細胞可表達TLR2及TLR4，利用siRNA干擾技術，有效抑制了TLR2和TLR4mRNA的表達，抑制率分別達到了94％和84％，同時蛋白表達水平也受到了顯著的抑制，說明本實驗篩選TLR2，TLR4的siRNA具有高效性，高特異性，是一種選擇性沉默基因表達的有效工具。當TLR2及TLR4受到siRNA抑制后，在相同濃度的HMGB1刺激下，細胞遷移能力的增加受到了明顯的

17、抑制，同時NF-κB細胞核內(nèi)活化能力下降，但是細胞增殖的變化未受到明顯影響。以上表明HMGB1可通過TLR2，TLR4及NF-κB促進成骨細胞遷移，并不影響細胞的增殖能力。聯(lián)合文獻報道HMGB1可刺激骨髓間充質(zhì)干細胞的遷移，并可聯(lián)合其他炎性因子促進破骨細胞的形成，可推測HMGB1在骨系統(tǒng)中可通過協(xié)調(diào)成骨系統(tǒng)和破骨系統(tǒng)的作用來完成骨損傷后的修復和軟骨內(nèi)成骨過程，本研究對HMGB1對成骨細胞的具體作用及相關可能機制提供了重要補充，首次顯示激