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文檔簡介
1、目的:
1.研究HMGB1對大鼠成骨細胞增殖及遷移的影響:重組HMGB1對體外培養(yǎng)的大鼠成骨細胞增殖以及遷移能力的影響及規(guī)律。
2.研究HMGB1影響成骨細胞遷移的分子機制:通過利用小干擾RNA干擾技術研究toll樣受體2(TLR2)及toll樣受體4(TLR4)在成骨細胞遷移過程中的作用及對相關轉錄因子核因子-κB(NF-κB)的活化影響,確定其作用途徑和分子機制。
方法:
1.材料和試劑:SD
2、大鼠成骨細胞購自中國天津威凱生物公司;胎牛血清,胰酶及DMEM培養(yǎng)液;四甲基偶氮唑藍(MTT)和二甲基亞砜(DMSO);Trizol及Turbofect轉染試劑;逆轉錄試劑盒及PCR試劑盒;NE-PER胞核胞漿提取試劑盒;rhHMGB1;TLR2,TLR4,NF-κB p65及GAPDH的抗體。
2.細胞培養(yǎng):將成骨細胞以每孔2×105個接種于六孔板,用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)于37℃,5% CO2的孵箱中,每兩天
3、更換一次培養(yǎng)液,將細胞分為空白對照組,TLR2-siRNA轉染組和TLR4-siRNA轉染組。
3.TLR2及TLR4 siRNAs的設計及轉染:設計合成三對針對TLR2,TLR4的siRNA,以與人類基因無同源性的siRNA作為陰性對照(siRNA序列見正文);將成骨細胞培養(yǎng)至70-80%融合時,吸去舊的培養(yǎng)基,用PBS輕洗2次,每孔加入1.6ml無血清培養(yǎng)基,置于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中;取濃度為20μM的siRNA/
4、microRNA2μl,加入400μl無血清培養(yǎng)基中,混勻后,加入4μl TurbofectsiRNA轉染試劑,混勻后在室溫下孵育15-20min;每孔加入上述孵育好的轉染復合液400μl,置于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4-6h后換成正常的完全培養(yǎng)基,轉染后24-48h,檢測mRNA及蛋白表達水平。
4.RT-PCR: siRNA轉染24h后收集細胞,按照Trizol說明書進行細胞總RNA提取,反轉錄合成cDNA。后以c
5、DNA為模板,進行PCR擴增(引物序列見正文)。反應條件為95℃10min;然后95℃15s,60℃30s,72℃15s,95℃15s,共40個循環(huán);然后60℃1min,95℃15s。繪制熔解曲線及標準曲線,以GAPDH為內(nèi)參,通過ΔΔCT方法分析基因的表達結果。至少重復進行三次單獨的實驗。
5.Western印跡法及蛋白細胞漿細胞核抽提技術:siRNA轉染24h后收集細胞,提取細胞總蛋白,采用BCA法進行蛋白定量;采用細胞核
6、及細胞漿提取試劑盒提取NF-κB p65胞核和胞漿蛋白,Lamin B1和GAPDH分別作為胞核和胞漿內(nèi)參,采用BCA法進行蛋白定量。取等量蛋白40μg上樣,進行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯胺凝膠電泳(SDS-PAGE),濃縮膠80V,分離膠120V恒壓電泳,350mA恒流轉膜1h。然后用5%脫脂奶粉的TBST液中封閉2h,加入抗TLR2,TLR4及GAPDH抗體4℃孵育過夜,次日室溫孵育1h后TBST洗膜10 min3次,用辣根過氧化
7、物酶標記的多克隆山羊抗兔IgG孵育1h,TBST洗膜10 min3次,增強型化學發(fā)光試劑(ECL)顯色,X膠片曝光,采集圖像。采用Uvipro凝膠成像系統(tǒng)掃描膠片,IPP6.0軟件分析光密度值,以目的蛋白和相應內(nèi)參條帶的光密度比值表示目的蛋白的表達水平。
6.細胞增殖測定:采用MTT法檢測細胞增殖情況,取不同組成骨細胞按5×103個/mL接種至96孔板,每孔200μl,設置3個復孔,置于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1-3d,
8、在培養(yǎng)結束前4h每孔加入20μl MTT溶液,然后培養(yǎng)結束后棄去培養(yǎng)液,每孔加入150μl DMSO,震蕩10min,酶標儀檢測492 nm處的吸光值。
7.細胞遷移測定:采用Boyden Transwell小室法(24孔微孔聚碳酸酯膜,孔直徑8.0μm,膜厚度6.5 mm)進行細胞遷移檢測,將細胞密度調(diào)整為1×105個/mL經(jīng)不同處理后的成骨細胞100μl加入上室中,下室加入500μl含15%FBS的DMEM培養(yǎng)液,置于37
9、℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h后,棄去培養(yǎng)液,用棉簽擦去上室內(nèi)未遷移的細胞,95%酒精常溫固定30min,結晶紫染色20min,PBS清洗,在顯微鏡10倍視野下觀察,每一樣本隨機選取4-5個視野,計數(shù)每個視野下染色細胞數(shù)量,取其平均值。
統(tǒng)計分析:
應用SPSS18.0進行統(tǒng)計分析,數(shù)值變量資料以均數(shù)±標準差(M±SD)表示,每組實驗重復三次,組間比較采用單因素方差分析,P<0.05被認為差異有統(tǒng)計學意義。
10、 結果:
1.HMGB1促進成骨細胞遷移,同時不影響成骨細胞增殖
我們利用Boyden Transwell小室法檢測細胞的遷移能力,利用MTT法檢測細胞的增殖能力。將細胞培養(yǎng)液中分別加入濃度為0,50,100,150,200μg/L的重組人HMGB1,進行培養(yǎng)24h后,將各組細胞加入Transwell小室的上層中,進行遷移實驗。結果發(fā)現(xiàn)遷移4h后,大量的成骨細胞轉移到下層,通過計數(shù)發(fā)現(xiàn)HMGB1可促進成骨細胞遷移,并
11、呈濃度依賴性,在濃度為150μg/l時細胞遷移能力最強,為對照組的2倍(p<0.05)。選擇該濃度進行下一步實驗。MTT法顯示不同濃度HMGB1刺激下細胞的增殖能力無明顯改變。
2.siRNA轉染可有效抑制成骨細胞TLR2,TLR4的mRNA及蛋白表達水平
通過RT-PCR及Western印記法檢測轉染24h后成骨細胞TLR2,TLR4的mRNA及蛋白表達水平。結果表明3組針對TLR2及TLR4的siRNA都能有效沉
12、默相應受體mRNA及蛋白的表達(p<0.05);其中TLR2-siRNA392,TLR4-siRNA703組與空白對照組相比,TLR2及TLR4的mRNA表達水平分別下調(diào)了94%和84%,蛋白表達水平分別下調(diào)了52%和35%(p<0.05)。因此后續(xù)實驗選用TLR2-siRNA392,TLR4-siRNA703進行基因轉染。
3.HMGB1通過TLR2或TLR4誘導成骨細胞NF-κB的活化
選擇沉默效率最高的TLR2
13、-siRNA392,TLR4-siRNA703進行轉染后,將細胞分為3組,分別為對照組, TLR2-siRNA組, TLR4-siRNA組,通過胞漿胞核提取技術及Western印跡法檢測各組細胞在受到重組人HMGB1刺激前后細胞核內(nèi)外NF-κB p65的含量。當對照組成骨細胞受到HMGB1刺激后,細胞核內(nèi)NF-κB p65明顯升高,但利用TLR2-siRNA及TLR4-siRNA轉染細胞后,細胞TLR2及TLR4表達下降后,在同樣重組H
14、MGB1刺激下,細胞核內(nèi)NF-κB p65增加的含量較未轉染組降低,降至對照組的47%和75%(p<0.05)。
4.HMGB1通過TLR2或TLR4誘導成骨細胞的遷移
選擇沉默效率最高的TLR2-siRNA392,TLR4-siRNA703轉染后,將細胞分為3組,分別為對照組,TLR2-siRNA組, TLR4-siRNA組,檢測各組細胞在受到重組人HMGB1刺激前后改變的遷移數(shù)量。實驗發(fā)現(xiàn)對照組成骨細胞受到重組人
15、HMGB1(150μg/l)刺激后,細胞遷移能力增加了2倍(P<0.05),但TLR2-siRNA組及TLR4-siRNA組在相同濃度的HMGB1刺激下,增加的細胞遷移數(shù)量較對照組明顯降低(P<0.01)。說明TLR2/TLR4參與了HMGB1誘導的成骨細胞遷移。
結論:
在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)重組人HMGB1可促進大鼠成骨細胞遷移,大鼠成骨細胞在受到重組人HMGB1刺激后,通過Transwell實驗發(fā)現(xiàn)細胞遷移能力較
16、對照組增加了2.3倍,MTT實驗顯示細胞的增殖能力未受到明顯影響。成骨細胞可表達TLR2及TLR4,利用siRNA干擾技術,有效抑制了TLR2和TLR4mRNA的表達,抑制率分別達到了94%和84%,同時蛋白表達水平也受到了顯著的抑制,說明本實驗篩選TLR2,TLR4的siRNA具有高效性,高特異性,是一種選擇性沉默基因表達的有效工具。當TLR2及TLR4受到siRNA抑制后,在相同濃度的HMGB1刺激下,細胞遷移能力的增加受到了明顯的
17、抑制,同時NF-κB細胞核內(nèi)活化能力下降,但是細胞增殖的變化未受到明顯影響。以上表明HMGB1可通過TLR2,TLR4及NF-κB促進成骨細胞遷移,并不影響細胞的增殖能力。聯(lián)合文獻報道HMGB1可刺激骨髓間充質(zhì)干細胞的遷移,并可聯(lián)合其他炎性因子促進破骨細胞的形成,可推測HMGB1在骨系統(tǒng)中可通過協(xié)調(diào)成骨系統(tǒng)和破骨系統(tǒng)的作用來完成骨損傷后的修復和軟骨內(nèi)成骨過程,本研究對HMGB1對成骨細胞的具體作用及相關可能機制提供了重要補充,首次顯示激
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