肝衰竭時(shí)肝細(xì)胞高遷移率族蛋白1的移位及釋放研究.pdf

1、肝衰竭是一種病死率很高的臨床危重癥，在我國肝衰竭最主要的原因是病毒性肝炎，其中最主要的是乙肝病毒( hepatitis Bvirus，HBV)感染。而高遷移率族蛋白l(high mobility group box-1protein，HMGB1)在細(xì)胞外是一種關(guān)鍵的“晚期”促炎癥介質(zhì)，已經(jīng)成為膿毒癥防治研究中一個(gè)重要的新靶標(biāo)。有研究表明HMGB1可能在重型肝炎肝衰竭中發(fā)揮重要作用。本研究旨在探討肝衰竭時(shí)肝細(xì)胞HMGB1的移位及釋放情況。

2、 目的：(1)研究LPS或TNF-α，刺激是否可引起肝細(xì)胞HMGB1的移位及釋放，檢測(cè)是否同時(shí)伴有其他細(xì)胞因子的分泌；(2)研究慢性重型乙型肝炎患者肝細(xì)胞HMGB1移位；(3)研究D-GaIN+LPS誘導(dǎo)的急性肝衰竭小鼠肝細(xì)胞HMGB1移位；(4)初步探討肝細(xì)胞HMGB1移位及釋放的可能機(jī)制。 方法：(1)體外用不同濃度LPS或TNF-α刺激肝細(xì)胞系HepG2細(xì)胞，不同時(shí)間點(diǎn)分別收集細(xì)胞和培養(yǎng)上清。MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率

3、，TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，同時(shí)測(cè)定培養(yǎng)上清中的LDH含量，以明確細(xì)胞是否凋亡或壞死。Western blotting方法檢測(cè)培養(yǎng)上清，細(xì)胞核和細(xì)胞漿組分蛋白中HMGB1的含量，免疫熒光技術(shù)觀察HMGB1移位。ELISA，細(xì)胞因子芯片技術(shù)檢測(cè)上清中的細(xì)胞因子分泌。(2)分別收集慢性重型乙型肝炎，慢性乙型肝炎患者及正常肝組織，免疫組織化學(xué)染色觀察HMGB1在肝細(xì)胞中的分布情況。同時(shí)行HE染色，評(píng)估肝組織的病理學(xué)改變。(3) D-GaIN

4、聯(lián)合LPS腹腔注射，誘導(dǎo)小鼠急性肝衰竭模型，同時(shí)設(shè)置生理鹽水對(duì)照組。于D-GalN+LPS注射后3h處死動(dòng)物，收集肝臟組織，進(jìn)行HMGB1的免疫組織化學(xué)染色。(4)用Western blotting和免疫熒光技術(shù)，分別觀察來普霉素B(LMB)和曲古霉素(TSA)對(duì)LPS誘導(dǎo)的肝細(xì)胞HMGB1移位和釋放的影響。 結(jié)果：(1)體外用LPS或TNF-α刺激可誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞釋放HMGB1，釋放到上清中的HMGB1量隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)而

5、增高，20h時(shí)達(dá)到峰值，免疫熒光觀察到HepG2細(xì)胞胞核中的HMGB1發(fā)生了向細(xì)胞漿的移位。在一定劑量范圍內(nèi)，LPS(≤400ng/mL)或TNF-α(≤25ng/mL)誘導(dǎo)的HMGB1分泌量隨LPS或TNF-α劑量增加而增加。MTT，TUNEL檢測(cè)及上清中LDH含量測(cè)定排除了細(xì)胞處于凋亡及壞死狀態(tài)。細(xì)胞組分蛋白Westem blotting分析亦證實(shí)了細(xì)胞漿中的HMGB1表達(dá)增強(qiáng)。ELISA和細(xì)胞因子抗體芯片檢測(cè)表明LPS，TNF-α

6、或重組HMGB1刺激HepG2細(xì)胞24h，僅見個(gè)別其他細(xì)胞因子的釋放。(2)慢性重型乙型肝炎患者肝細(xì)胞中可觀察到明顯的HMGB1的移位，移位率約為32.84％±7.13％。而在慢性乙型肝炎組及正常肝組織中，肝細(xì)胞HMGB1集中分布于細(xì)胞核中，未見明顯的移位。(3) D-GalN+LPS注射后3h，發(fā)生移位的肝細(xì)胞百分率為：27.42％±4.99％。移位率與生理鹽水對(duì)照組比較，顯著為高(P<0.01)。(4)體外CRM1抑制劑LMB可以顯

7、著減少LPS誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞HMGB1的釋放，及HMGB1從細(xì)胞核向細(xì)胞漿的移位。組蛋白去乙?；敢种苿㏕SA可以促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的HMGB1釋放，促進(jìn)HMGB1從細(xì)胞核向細(xì)胞漿的移位。 結(jié)論：(1) LPS或TNF-a可時(shí)間及劑量依賴性誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞核蛋白HMGB1的移位及釋放。(2)慢性重型乙型肝炎患者肝細(xì)胞中存在HMGB1從細(xì)胞核向胞漿的移位，而在慢性乙型肝炎及正常對(duì)照肝細(xì)胞中并無這種移位現(xiàn)象。(3)D-G