雷公藤多苷聯(lián)合小檗堿對(duì)糖尿病腎病大鼠腎小球足細(xì)胞相關(guān)因子的干預(yù)研究.pdf

1、目的:
　　糖尿病腎病(Diabetic nephropathy，DN)是糖尿病(Diabetes mellitus，DM)主要的微血管并發(fā)癥之一，以高血壓、蛋白尿和進(jìn)行性腎功能喪失為特征，是導(dǎo)致終末期腎病(End stage renal disease，ESRD)的重要原因。DN有多種發(fā)病機(jī)制，但大量研究表明腎小球足細(xì)胞的損傷在DN發(fā)生發(fā)展中占重要地位。本實(shí)驗(yàn)將不同劑量雷公藤多苷（Tripterygium wilfordii p

2、olyglucoside，TWP）以及聯(lián)合小檗堿（Berberine，BBR）預(yù)防性和治療性應(yīng)用于高糖高脂飼料喂養(yǎng)加小劑量鏈脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）注射模擬的T2DM和DN大鼠動(dòng)物模型，探討雷公藤多苷、小檗堿及聯(lián)合用藥對(duì)DN腎小球足細(xì)胞及相關(guān)因子的干預(yù)作用及可能的機(jī)制。
　　方法：
　　清潔級(jí)雄性SD大鼠260只，隨機(jī)選取20只分為預(yù)防正常對(duì)照組（PNC組）10只、治療正常對(duì)照組（TNC組）10只，飼

3、以常規(guī)飼料;其余240只大鼠以高糖高脂飼料喂養(yǎng)8周聯(lián)合小劑量STZ尾靜脈注射建立T2DM模型，將成模大鼠隨機(jī)分為預(yù)防(P)組與治療(T)組。預(yù)防組包括:模型對(duì)照預(yù)防組（PDM組）、雷公藤多苷低、中、高劑量預(yù)防組（PTL組TWP1mg/kg·d、PTM組TWP3mg/kg·d、PTH組TWP6mg/kg·d）、小檗堿預(yù)防組（PB組BBR150mg/kg·d）、雷公藤多苷低、中、高劑量聯(lián)合小檗堿預(yù)防組(PTBL組TWP1mg/kg·d+BB

4、R150mg/kg·d、PTBM組TWP3mg/kg·d+BBR150mg/kg·d、PTBH組TWP6mg/kg·d+BBR150mg/kg·d)。治療組包括:模型對(duì)照治療組（TDM組）、雷公藤多苷低、中、高劑量治療組(TTL組TWP3mg/kg·d、TTM組TWP6mg/kg·d、TTH組TWP9mg/kg·d)、小檗堿治療組（TB組BBR150mg/kg·d）、雷公藤多苷低、中、高劑量聯(lián)合小檗堿治療組(TTBL組TWP3mg/kg

5、·d+BBR150mg/kg·d、TTBM組TWP6mg/kg·d+BBR150mg/kg·d、TTBH組TWP9mg/kg·d+BBR150mg/kg·d)。每組15只。預(yù)防組于成模后即開始灌胃，治療組于成模后第7周開始灌胃，均灌胃8周后處死。實(shí)驗(yàn)過程中記錄大鼠體重、血糖、24小時(shí)尿微量白蛋白變化。STZ注射前內(nèi)眥取血測(cè)血脂、空腹胰島素。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí):①留取血標(biāo)本用于肝腎功能、血脂、血常規(guī)測(cè)定以及ELISA法檢測(cè)血清Nephrin、VE

6、GF水平的變化;②記錄腎臟重量(KW)，留取腎組織。電鏡觀察足細(xì)胞病理變化。免疫組化法觀察Nephrin、VEGF在腎小球的表達(dá);RT-PCR法檢測(cè)Nephrin、VEGF的mRNA表達(dá)水平;Western Blotting法檢測(cè)Nephrin、VEGF的蛋白表達(dá)量。
　　結(jié)果：
　　1、造模結(jié)果:高糖高脂飼料喂養(yǎng)組大鼠8周后甘油三酯(TG)、膽固醇(TC)、空腹胰島素(FINS)較正常對(duì)照組明顯升高(P＜0.05);STZ

7、注射后，糖尿病各組大鼠血糖明顯升高，體重顯著下降，出現(xiàn)“三多一少”等癥狀。治療組大鼠自成模后第6周末UMA水平明顯高于正常對(duì)照組(P＜0.05)。
　　2、一般指標(biāo):①體重、血糖:灌胃8周末，與PNC、TNC相比，糖尿病組與各干預(yù)用藥組大鼠體重均明顯下降(P＜0.05)，血糖均明顯升高(P＜0.05)，雷公藤多苷和小檗堿灌胃對(duì)大鼠體重、血糖無顯著影響（P＞0.05）。②血脂:灌胃8周末，與PNC、TNC相比，糖尿病組與各干預(yù)用藥組

8、大鼠TG、TC均明顯升高(P＜0.05)，雷公藤多苷和小檗堿灌胃后無顯著影響(P＞0.05)。③灌胃8周末，肝功能、腎功能、血常規(guī)在各組間均無明顯差異(P＞0.05)，雷公藤多苷和小檗堿灌胃后無顯著影響(P＞0.05)。
　　3、24h尿微量白蛋白(UMA):①預(yù)防組:與PDM組相比，雷公藤多苷、小檗堿及雷公藤多苷聯(lián)合小檗堿預(yù)防組大鼠UMA水平均有顯著性下降(P＜0.05)，且呈劑量依賴性;中、高劑量組(PTM、PTH、PTBM、

9、PTBH)下降最明顯(P＜0.05)。②治療組:與TDM組相比，雷公藤多苷及雷公藤多苷聯(lián)合小檗堿治療組UMA水平有顯著性下降(P＜0.05)，且呈劑量依賴性;中、高劑量組(TTM、TTH、TTBM、TTBH)下降最明顯(P＜0.05)，小檗堿治療組(TB)與其無明顯差異(P＞0.05)。
　　4、腎重指數(shù)(KW/BW):①預(yù)防組:與PDM組相比，雷公藤多苷、小檗堿及雷公藤多苷聯(lián)合小檗堿預(yù)防組大鼠KW/BW水平均有顯著性下降（P＜0

10、.05）;PTH組下降最明顯(P＜0.05)。②治療組:與TDM組相比，TTH、TB、TTBL、TTBM和TTBH組有明顯下降（P＜0.05)。
　　5.電鏡觀察腎組織病理結(jié)構(gòu)變化:①預(yù)防組:PDM組腎小球足細(xì)胞足突融合，細(xì)胞膜破裂。與PDM組相比，雷公藤多苷、小檗堿及雷公藤多苷聯(lián)合小檗堿預(yù)防組病理改變均減輕，且呈劑量依賴性;中、高劑量組(PTM、PTH、PTBM、PTBH)改善最明顯。②治療組:TDM組大鼠腎小球足突融合，細(xì)胞膜

11、破裂。與TDM組相比，雷公藤多苷及雷公藤多苷聯(lián)合小檗堿治療組上述病理改變均減輕，且呈劑量依賴性;中、高劑量組(TTM、TTH、TTBM、TTBH)改善最明顯。
　　6、采用ELISA技術(shù)檢測(cè)大鼠血清Nephrin、VEGF水平:①預(yù)防組:與PDM組相比，雷公藤多苷、小檗堿及雷公藤多苷聯(lián)合小檗堿預(yù)防組大鼠血清Nephrin水平無明顯差異(P＞0.05);血清VEGF水平均有顯著性下降(P＜0.05)，且呈劑量依賴性，中、高劑量組(P

12、TM、PTH、PTBM、PTBH)下降最明顯(P＜0.05)。②治療組:與TDM組相比，雷公藤多苷及雷公藤多苷聯(lián)合小檗堿治療組大鼠血清Nephrin水平無明顯差異(P＞0.05);血清VEGF水平均有顯著性下降(P＜0.05)，且呈劑量依賴性，中、高劑量組(TTM、TTH、TTBM、TTBH)下降最明顯(P＜0.05)，小檗堿治療組(TB)與其無明顯差異(P＞0.05)。
　　7、采用免疫組化技術(shù)檢測(cè)大鼠腎臟Nephrin、VEG

13、F蛋白表達(dá)水平:①預(yù)防組:與PDM組相比，雷公藤多昔、小檗堿及雷公藤多苷聯(lián)合小檗堿預(yù)防組大鼠腎臟腎小球足細(xì)胞Nephrin免疫染色逐漸增強(qiáng)，腎小球VEGF免疫染色逐漸減弱，且呈劑量依賴性，中、高劑量組(PTM、PTH、PTBM、PTBH)改善最明顯。②治療組:與TDM組相比，雷公藤多苷及雷公藤多苷聯(lián)合小檗堿治療組大鼠腎臟腎小球足細(xì)胞Nephrin免疫染色逐漸增強(qiáng)，腎小球VEGF免疫染色逐漸減弱，且呈劑量依賴性，中、高劑量組(TTM、TT

14、H、TTBM、TTBH)改善最明顯。
　　8.采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)大鼠腎臟Nephrin、VEGF mRNA表達(dá)水平:①預(yù)防組:與PDM組相比，雷公藤多苷、小檗堿及雷公藤多苷聯(lián)合小檗堿預(yù)防組大鼠腎臟Nephrin mRNA表達(dá)水平均顯著升高(P＜0.05)，VEGF mRNA表達(dá)水平均有顯著性下降（P＜0.05），且呈劑量依賴性，中、高劑量組(PTM、PTH、PTBM、PTBH)改善最明顯(P＜0.05)。②治療組:與TDM組

15、相比，雷公藤多苷及雷公藤多苷聯(lián)合小檗堿治療組大鼠腎臟Nephrin mRNA表達(dá)水平均顯著升高(P＜0.05)，VEGF mRNA表達(dá)水平均有顯著性下降(P＜0.05)，且呈劑量依賴性，中、高劑量組(TTM、TTH、TTBM、TTBH)改善最明顯(P＜0.05)，小檗堿治療組(TB)與其無明顯差異(P＞0.05)。
　　9、采用Western Blotting技術(shù)檢測(cè)大鼠腎臟Nephrin、VEGF蛋白表達(dá)量:①預(yù)防組:與PDM組

16、相比，雷公藤多苷、小檗堿及雷公藤多苷聯(lián)合小檗堿預(yù)防組大鼠腎臟Nephrin蛋白表達(dá)量均顯著升高（P＜0.05），VEGF蛋白表達(dá)量均有顯著性下降（P＜0.05），且呈劑量依賴性，中、高劑量組(PTM、PTH、PTBM、PTBH)改善最明顯(P＜0.05)。②治療組:與TDM組相比，雷公藤多苷及雷公藤多苷聯(lián)合小檗堿治療組大鼠腎臟Nephrin蛋白表達(dá)量均顯著升高(P＜0.05)，VEGF蛋白表達(dá)量均有顯著性下降（P＜0.05），且呈劑量依

17、賴性，中、高劑量組(TTM、TTH、TTBM、TTBH)改善最明顯（P＜0.05），小檗堿治療組(TB)與其無明顯差異（P＞0.05）。
　　結(jié)論
　　1、本實(shí)驗(yàn)成功制備2型糖尿病和DN大鼠模型。
　　2、應(yīng)用中劑量、高劑量雷公藤多苷及雷公藤多苷聯(lián)合小檗堿早期預(yù)防和治療DN，可顯著降低尿蛋白水平。
　　3、DN大鼠血清和腎臟中Nephrin的表達(dá)水平較正常對(duì)照組明顯下降，VEGF的表達(dá)水平較正常對(duì)照組明顯升高，提