雷公藤多苷聯(lián)合小檗堿對(duì)糖尿病腎病大鼠腎小球內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)因子的干預(yù)研究.pdf

1、目的：
　　糖尿病腎病(Diabetic nephropathy，DN)是糖尿病(Diabetes mellitus，DM)最主要的微血管并發(fā)癥之一。目前關(guān)于DN機(jī)制的研究涉及諸多方面，其中腎小球屏障功能的損害是導(dǎo)致蛋白尿的直接原因，而腎小球內(nèi)皮細(xì)胞則是腎小球?yàn)V過(guò)膜的重要組成部分。本研究選用高糖高脂飼料喂養(yǎng)聯(lián)合小劑量鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)尾靜脈注射建立T2DM和DN大鼠模型為研究對(duì)象，予雷公藤多苷(TW

2、P)聯(lián)合小檗堿(BBR)分別于正常白蛋白尿期和微量白蛋白尿期進(jìn)行干預(yù)，探討其對(duì)腎小球內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)因子單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)和血管細(xì)胞黏附分子-1(VCAM-1)的影響。
　　方法：
　　清潔級(jí)雄性SD大鼠260只，隨機(jī)選取20只分別作為預(yù)防組正常對(duì)照組(PNC組，n=10)、治療組正常對(duì)照組（TNC組，n=10），以常規(guī)飼料喂養(yǎng)。其余240只大鼠以高糖高脂飼料喂養(yǎng)，8周后予STZ（30mg/kg）尾靜脈注射建立T

3、2DM模型。將成模大鼠隨機(jī)分為預(yù)防(P)組和治療(T)組，各120只大鼠。
　　預(yù)防組分為模型對(duì)照(PDM)組、雷公藤多苷單藥組、小檗堿單藥(PB，BBR150mg/kg·d)組和雷公藤多苷聯(lián)合小檗堿組。其中雷公藤多苷單藥組根據(jù)應(yīng)用雷公藤多苷的劑量進(jìn)一步分為低（TWP1mg/kg·d）、中（TWP3mg/kg·d）、高(TWP6mg/kg·d)劑量(PTL、PTM、PTH)組;雷公藤多苷聯(lián)合小檗堿組根據(jù)應(yīng)用雷公藤多苷的劑量進(jìn)一步分

4、為低劑量雷公藤多苷聯(lián)合小檗堿(PTBL，TWP1mg/kg·d+BBR150mg/kg·d)組、中劑量雷公藤多苷聯(lián)合小檗堿(PTBM，TWP3mg/kg·d+BBR150mg/kg·d)組、高劑量雷公藤多苷聯(lián)合小檗堿(PTBH，TWP6mg/kg·d+BBR150mg/kg·d)組，每組各15只，成模后即開(kāi)始灌胃，正常對(duì)照(PNC)組和模型對(duì)照(PDM)組以等量蒸餾水(2ml)灌胃，灌胃8周末處死取材。
　　治療組分為模型對(duì)照(T

5、DM)組、雷公藤多苷單藥組、小檗堿單藥(TB，BBR150mg/kg·d)組，雷公藤多苷聯(lián)合小檗堿組。其中雷公藤多苷單藥組根據(jù)應(yīng)用雷公藤多苷的劑量進(jìn)一步分為低（TWP3mg/kg·d）、中（TWP6mg/kg·d）、高（TWP9mg/kg·d）劑量(TTL、TTM、TTH)組;雷公藤多苷聯(lián)合小檗堿組根據(jù)應(yīng)用雷公藤多苷的劑量進(jìn)一步分為低劑量雷公藤多苷聯(lián)合小檗堿(TTBL，TWP3mg/kg·d+BBR150mg/kg·d)組、中劑量雷公藤

6、多苷聯(lián)合小檗堿(TTBM，TWP6mg/kg·d+BBR150mg/kg·d)組、高劑量雷公藤多苷聯(lián)合小檗堿(TTBH，TWP9mg/kg·d+BBR150mg/kg·d)組，每組各15只，成模6周后開(kāi)始灌胃，正常對(duì)照(TNC)組和模型對(duì)照(TDM)組以等量蒸餾水(2ml)灌胃，灌胃8周末處死取材。
　　實(shí)驗(yàn)過(guò)程中記錄大鼠體重(BW)、血糖、24小時(shí)尿微量白蛋白(UMA)變化;處死取材時(shí)記錄BW、腎重(KW);留取血標(biāo)本檢測(cè)血糖、

7、肝腎功能、血脂、血常規(guī);采用ELISA法檢測(cè)大鼠血清中MCP-1、VCAM-1水平;留取腎組織標(biāo)本，電鏡觀察大鼠腎組織腎小球?yàn)V過(guò)膜超微結(jié)構(gòu)改變，分別應(yīng)用RT-PCR法、Western Blotting法和免疫組化法檢測(cè)大鼠腎組織中MCP-1和VCAM-1的mRNA和蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.高糖高脂飼料喂養(yǎng)8周后大鼠血脂、胰島素水平和HOMA-IR、HOMA-β指數(shù)較常規(guī)飼料組明顯升高(P＜0.05);STZ注射后，

8、高糖高脂飼料喂養(yǎng)大鼠血糖明顯升高，體重明顯減輕，同時(shí)伴有多飲、多尿、多食等癥狀，成模6周后實(shí)驗(yàn)大鼠24h尿微量白蛋白明顯升高。
　　2.一般指標(biāo):①體重、血糖:與PNC、TNC組相比，預(yù)防和治療各組大鼠造模后血糖明顯升高(P＜0.05)，體重明顯下降（P＜0.05），雷公藤多苷和小檗堿灌胃對(duì)大鼠體重、血糖未見(jiàn)顯著影響(P＞0.05);②腎重指數(shù)(KW/BW):與PNC、TNC組相比，PDM和TDM組大鼠KW/BW均明顯升高（P＜0

9、.05），預(yù)防組大鼠經(jīng)雷公藤多苷和小檗堿灌胃后KW/BW均有所下降(P＜0.05)，以PTH組下降最為明顯;治療組大鼠經(jīng)雷公藤多苷和小檗堿灌胃后，TTH組、TB組及雷公藤多苷聯(lián)合小檗堿各組(TTBL、TTBM、TTBH)大鼠KW/BW下降有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);③血脂:與PNC、TNC組相比，糖尿病各組大鼠甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)水平顯著升高(P＜0.05)，雷公藤多苷和小檗堿灌胃后未見(jiàn)顯著影響(P＞0.05);④肝、腎

10、功能、血常規(guī):大鼠肝、腎功能和血常規(guī)在各組間均無(wú)明顯差異（P＞0.05），雷公藤多苷和小檗堿灌胃后未見(jiàn)顯著影響（P＞0.05）。
　　3.24h尿微量白蛋白(UMA):①預(yù)防組:與PNC組相比，糖尿病各組大鼠UMA水平明顯升高(P＜0.05);與PDM組相比，雷公藤多苷單藥各組、小檗堿單藥組和雷公藤多苷聯(lián)合小檗堿各組大鼠UMA水平明顯降低(P＜0.05)，且呈劑量依賴(lài)性;②治療組:與TNC組相比，糖尿病各組大鼠UMA水平明顯升高(

11、P＜0.05):與TDM組相比，雷公藤多苷單藥各組和雷公藤多苷聯(lián)合小檗堿各組大鼠UMA水平明顯降低（P＜0.05），呈劑量依賴(lài)性。
　　4.電鏡觀察腎小球?yàn)V過(guò)膜變化:正常對(duì)照組大鼠腎小球內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量、形態(tài)、毛細(xì)血管腔的大小和內(nèi)容物未見(jiàn)明顯異常。糖尿病各組大鼠可見(jiàn)腎小球內(nèi)皮細(xì)胞增生腫脹呈擁塞狀，向管腔內(nèi)突出等早期DN腎小球內(nèi)皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變，治療組較預(yù)防組相比更為嚴(yán)重。雷公藤多苷單藥各組、小檗堿組和雷公藤多苷聯(lián)合小檗堿各組上述病理

12、性超微結(jié)構(gòu)均有所改善。
　　5.采用ELISA法檢測(cè)大鼠血清中MCP-1、VCAM-1水平:①預(yù)防組:與PNC組相比，糖尿病各組大鼠血清MCP-1、VCAM-1水平明顯升高(P＜0.05);與PDM組相比，PTH、PTBM和PTBH組大鼠血清MCP-1、VCAM-1水平顯著下降（P＜0.05）;②治療組:與TNC組相比，糖尿病各組大鼠血清MCP-1、VCAM-1水平明顯升高(P＜0.05);與TDM組相比，大鼠血清MCP-1水平以

13、TTH、TTBL、TTBM和TTBH組下降明顯(P＜0.05)，而大鼠血清VCAM-1水平在TTM、TTH、TTBL、TTBM和TTBH組顯著下降（P＜0.05）。
　　6.應(yīng)用RT-PCR法檢測(cè)大鼠腎組織中MCP-1、VCAM-1mRNA的表達(dá):①預(yù)防組:與PNC組相比，糖尿病各組大鼠腎組織中MCP-1、VCAM-1mRNA表達(dá)明顯升高(P＜0.05);與PDM組相比，雷公藤多苷單藥各組、小檗堿單藥組和雷公藤多苷聯(lián)合小檗堿各組大

14、鼠腎組織中MCP-1、VCAM-1mRNA表達(dá)明顯降低（P＜0.05），且呈劑量依賴(lài)性;②治療組:與TNC組相比，糖尿病各組大鼠腎組織中MCP-1、VCAM-1mRNA表達(dá)明顯升高(P＜0.05);與TDM組相比，雷公藤多苷單藥各組和雷公藤多苷聯(lián)合小檗堿各組大鼠腎組織中MCP-1、VCAM-1mRNA表達(dá)明顯降低（P＜0.05），呈劑量依賴(lài)性。
　　7.應(yīng)用Western Blotting法檢測(cè)大鼠腎組織中MCP-1、VCAM-1

15、蛋白的表達(dá):①預(yù)防組:與PNC組相比，糖尿病各組大鼠腎組織中MCP-1、VCAM-1蛋白表達(dá)明顯升高(P＜0.05);與PDM組相比，雷公藤多苷單藥各組、小檗堿單藥組和雷公藤多苷聯(lián)合小檗堿各組大鼠腎組織中MCP-1、VCAM-1蛋白表達(dá)明顯降低(P＜0.05)，且呈劑量依賴(lài)性;②治療組:與TNC組相比，糖尿病各組大鼠腎組織中MCP-1、VCAM-1蛋白表達(dá)明顯升高(P＜0.05);與TDM組相比，雷公藤多苷單藥各組和雷公藤多苷聯(lián)合小檗堿

16、各組大鼠腎組織中MCP-1、VCAM-1蛋白表達(dá)明顯降低(P＜0.05)，呈劑量依賴(lài)性。
　　結(jié)論：
　　1.通過(guò)高糖高脂飲食聯(lián)合小劑量STZ，成功制備T2DM和DN模型。
　　2.電鏡結(jié)果顯示DN大鼠腎小球內(nèi)皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變，同時(shí)大鼠腎組織中MCP-1、VCAM-1的mRNA水平和蛋白的表達(dá)明顯升高，提示腎小球內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子和黏附分子的改變與DN發(fā)生發(fā)展具有相關(guān)性。
　　3.雷公藤多苷單藥、小檗堿單藥或

17、二者聯(lián)合應(yīng)用可降低預(yù)防組大鼠尿蛋白水平，延緩DN發(fā)生，雷公藤多苷單藥或聯(lián)合小檗堿干預(yù)可降低治療組大鼠尿蛋白水平，減慢DN發(fā)展，而單獨(dú)應(yīng)用小檗堿對(duì)治療組大鼠效果不明顯。且實(shí)驗(yàn)大鼠應(yīng)用各劑量雷公藤多苷及小檗堿灌胃后均未觀察到明顯的肝腎損害和外周血細(xì)胞減少，安全性良好。
　　4.應(yīng)用雷公藤多苷和小檗堿干預(yù)可減少以MCP-1、VCAM-1為代表的腎小球內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞因子和黏附分子的表達(dá)，減輕內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)，修復(fù)濾過(guò)膜結(jié)構(gòu)，延緩DN發(fā)