雙氫菁蒿素對惡性膠質(zhì)瘤細胞的作用觀察.pdf

1、研究背景
　　 腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，約占顱內(nèi)腫瘤的40％-60％。其中又以膠質(zhì)母細胞瘤惡性程度最高。由于其呈浸潤性生長，單純手術(shù)往往難以根治，術(shù)后復(fù)發(fā)率很高，生存期平均為14個月。目前，對于膠質(zhì)瘤患者多采取綜合治療，包括手術(shù)切除、放療和化療。幾十年來，雖然神經(jīng)影像學(xué)技術(shù)和顯微外科技術(shù)取得巨大的進步，極大地推動了神經(jīng)外科的發(fā)展，但手術(shù)仍難以徹底的切除腫瘤。雖然手術(shù)后輔以放療可以提高膠質(zhì)瘤的治療效果，但由于放射劑

2、量的限制和有相當(dāng)一部分腫瘤對放療不敏感，大多數(shù)腫瘤出現(xiàn)治療后復(fù)發(fā)的現(xiàn)象。而且，現(xiàn)行的化療藥物由于耐藥性及難以透過血腦屏障等原因亦沒取得理想的療效。
　　 在膠質(zhì)瘤的發(fā)生過程中，一些相關(guān)基因或蛋白出現(xiàn)變化及更改，在不同的信號途徑對腫瘤的發(fā)生、細胞增殖、腫瘤轉(zhuǎn)移或凋亡起著重要作用。如表皮生長因子受體(epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR/ErbB(l))基因的過表達和擴增，血小板源生長因子受體(pla

3、telet-derivedgrowthfactorrecetor，PDGFR)的表達上調(diào)、控制細胞周期的INK4A-ARF的缺失、促進細胞凋亡的p53的突變或丟失等等，與腫瘤的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)。而針對這些基因或蛋白的的基因靶向治療方法大多正處于研究階段，尚未進入臨床。目前，化療藥物的輔助治療膠質(zhì)瘤治療，提高生存率仍是的膠治療治療研究的熱點。
　　 青蒿素(Artemisinin)是1971年我國科學(xué)家從菊科植物黃花蒿的葉和花蕾

4、中分離獲得的一種倍半萜內(nèi)酯過氧化物，其衍生物包括:雙氫青蒿素(DHA)、蒿甲醚、青蒿琥酯等。目前，青蒿素及其衍生物作為高效低毒的抗瘧藥已經(jīng)得到了全世界的公認。近10多年來國內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)青蒿素及其衍生物對體內(nèi)外多種細胞有明顯的誘導(dǎo)凋亡作用，特別是誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡。因此青蒿素被認為具有廣譜抗癌活性。并從青蒿素對腫瘤細胞的直接細胞毒性作用、影響腫瘤細胞的增殖周期、促進腫瘤細胞凋亡及抗腫瘤血管生成作用等多個方面，對青蒿素的抗腫瘤活性機制時行

5、研究。
　　 (1)氧自由基介導(dǎo)的細胞毒性作用。青蒿素作為一種抗瘧疾藥物，其目前公認的主要機制抗瘧疾機制為:青蒿素類藥物具有過氧化橋的新型倍半萜內(nèi)酯的結(jié)構(gòu)，與亞鐵原子起反應(yīng)后，過氧橋斷裂產(chǎn)生自由基等細胞內(nèi)活性氧(ROS)代謝產(chǎn)物，能引起細胞死亡。有研究表明，細胞對鐵的攝取與細胞表面的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體有關(guān)。在細胞分裂時，DNA復(fù)制需要鐵離子。而腫瘤細胞生長旺盛，分裂活躍，需要大量的鐵離子，故腫瘤細胞的鐵含量比正常細胞高出很多。因此，在

6、腫瘤細胞中鐵含量遠比正常細胞多的情況下，青蒿素對腫瘤細胞的作用，遠大于正常細胞。這提示了青蒿素作用于腫瘤細胞產(chǎn)生的ROS遠多于正常細胞，對腫瘤細胞產(chǎn)生毒性作用更大。可能是青蒿素及其衍生物選擇性抗腫瘤的機制之一。
　　 (2)細胞周期阻滯作用。細胞周期是指細胞完成一分為二復(fù)制生長周期。靜止的細胞，不進行分裂活動，稱為Go期，周期開始于一個起始點，由此靜細胞進入G1期，繼之為S期，即DNA合成期，然后進入G2期，最后細胞一分為二，是

7、為M期，即分裂期。細胞周期有兩個關(guān)鍵的過渡控制點:一在G2/M的交接處，一在G1/S期。許多實驗中觀察到，青蒿素類藥物作用腫瘤細胞后，細胞出現(xiàn)細胞周期阻滯現(xiàn)象。而不同部位組織的細胞，阻滯周期有所不同。這可能是青蒿素對不同部位腫瘤細胞的周期阻滯有一定的選擇性。但這種選擇性周期阻滯機制仍未明確。
　　 (3)誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡作用。細胞調(diào)亡是細胞程序性死亡。凋亡細胞出現(xiàn)特殊的形態(tài)改變和DNA裂解，這被認為是細胞凋亡過程的主要病理學(xué)標(biāo)志

8、。誘導(dǎo)細胞凋亡的原因及路徑很多。普遍認為已明確的細胞凋亡途徑有兩條。分別是:死亡受體途徑和線粒體途徑。對于青蒿素誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的機制，目前在不同組織腫瘤細胞中的研究結(jié)果出現(xiàn)許多觀點。以HL60細胞、A549細胞為模型研究發(fā)現(xiàn)，survivinmRNA和survivin蛋白的表達均降低。因此，有學(xué)者認為ART誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡效應(yīng)的機制，與IAPs家族成員survivin基因的表達受抑制有關(guān)。在研究青蒿酯鈉誘導(dǎo)肝癌細胞BEL-7402凋亡

9、作用時，研究人員發(fā)現(xiàn)肝癌細胞中p53、p21蛋白表達水平無明顯變化，而bcl-2蛋白表達水平降低，從而認為青蒿素誘導(dǎo)凋亡的分子機制是p53非依賴性的，與凋亡基因bcl-2下調(diào)有關(guān)。DHA誘導(dǎo)Hela細胞死亡實驗結(jié)果，顯示青蒿素誘導(dǎo)凋亡的分子機制為依賴線粒體途徑的非p53依賴性凋亡。但在結(jié)腸癌細胞株中，研究者卻認為，ART的作用主要是通過P53依賴性與非依賴性途徑介導(dǎo)細胞凋亡的。這些不同部位腫瘤細胞研究結(jié)果顯示，青蒿素誘導(dǎo)不同腫瘤細胞凋亡

10、的分子機制存在差異。另外，有學(xué)者研究認為，細胞內(nèi)過氧化橋的激活是細胞內(nèi)過氧化物導(dǎo)致的細胞死亡的原因。ART抗肝癌作用機理與其影響拓撲異構(gòu)酶介導(dǎo)的細胞凋亡有關(guān)。此外，細胞內(nèi)Ca2+濃度升高，引發(fā)的阻斷環(huán)磷酸腺苷介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)途徑有關(guān)。我國學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，DHA可誘導(dǎo)肺癌細胞凋亡，并伴隨有線粒體形態(tài)改變和caspase-3活化。提示DHA可能通過獨立caspase-3線粒體死亡途徑，抑制和誘導(dǎo)肺癌細胞凋亡。目前，關(guān)于青蒿素誘導(dǎo)膠質(zhì)細胞瘤凋亡，

11、特別是誘導(dǎo)惡性膠質(zhì)瘤細胞的凋亡機制尚未明確。
　　 (4)抑制血管生成作用。新生血管過度生長是多種病理過程的主要特點，尤其是腫瘤快速生長和轉(zhuǎn)移的重要基礎(chǔ)。大量實驗證明，多種腫瘤生成、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和愈后均與血管生成密切相關(guān)。血管生成是一個復(fù)雜的過程，要經(jīng)歷血管內(nèi)皮的增殖和遷移、實心條索的形成、管壁的膠原沉積以及外周細胞的形成等多個步驟才能完成。針對血管生成過程，進行青蒿素抑制新生血管的實驗研究發(fā)現(xiàn)，青蒿素能明顯推遲血管新生，減少新生

12、血管數(shù)量。這提示了，青蒿素可能與抑制血管新生的起始步驟，即與血管內(nèi)皮的增殖與遷移、管狀形成有關(guān)。實驗還發(fā)現(xiàn)，青蒿素在瘤血管生成中可抑制VEGF與受體結(jié)合，下調(diào)血管內(nèi)皮細胞上VEGF及其受體表達。提示ART在抗腫瘤血管生成中具有潛在的應(yīng)用價值。
　　 青蒿素的安全性。青蒿素及其衍生物作為一種廣泛應(yīng)用的抗瘧疾藥，其毒副作用分析在臨床上鮮有報道。在一項超過一萬人臨床試驗中，經(jīng)嚴(yán)密觀察，尚未有臨床相關(guān)毒副作用的報道。在動物實驗上，出現(xiàn)的

13、毒性反應(yīng)都是在使用高劑量情況下發(fā)生的。針對毒副作用的研究顯示，青蒿素及其衍生物的毒副作用，主要包括對造血系統(tǒng)抑制，胚胎毒性作用，神經(jīng)毒性等。在神經(jīng)毒性方面，主要針對神經(jīng)元細胞，而非膠質(zhì)細胞。另外，不同部位腦組織青蒿素的敏感性亦存在差異。例如，位于低位腦干的斜方體核、巨細胞網(wǎng)狀核、與小腦下腳的神經(jīng)元對蒿甲醚的毒性作用最敏感，而腦皮層神經(jīng)元則較少受影響。體外研究表明，神經(jīng)毒性呈劑量與時間依賴性的。另外，有研究發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)青蒿素類藥物肌肉注射比口

14、服毒性更大，酯溶性青蒿素類藥物比水溶性類藥物的毒性大，但這與青蒿素及其衍生物的藥效無關(guān)。前文提及青蒿素機制，存在選擇性抗腫瘤作用，而對正常組織作用較小。因此，我們認為青蒿素及其衍生物具有低毒和較高的安全性。具有成為臨床化療藥物的潛在價值。
　　 本實驗以此為依據(jù)，選擇青蒿素衍生物中作用效果更強的DHA，研究其在不同濃度、不同時間下觀察其對U87細胞的增殖、凋亡的影響，并對細胞凋亡的機制進行了初步探討。
　　 目的：探討雙

15、氫青蒿素(DHA)對人惡性膠質(zhì)母細胞瘤(U87)增殖和凋亡的影響。
　　 方法：體外培養(yǎng)的U87細胞，加入不同濃度的DHA(10μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、125μmol/L)分別經(jīng)行培養(yǎng)24h、48h和72h;倒置顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)變化,CCK8藥敏實驗檢測細胞增殖情況;流式細胞分析細胞周期變化;Hoechst33258染色觀察細胞凋亡;Caspse-3活性檢測及細胞內(nèi)活性氧(RO

16、S)檢測。DHA對U87細胞增殖的影響，不同濃度與不同時間的統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析(Univaraiate-ANOVA);兩兩比較方差齊時采用LSD法，方差不齊時選用Dunnett'sT3法;對兩組caspase-3蛋白表達統(tǒng)計分析，采用兩獨立樣本t-test。
　　 結(jié)果：DHA對U87細胞具有濃度和時間依賴性抑制細胞增殖作用。作用24h后IC50是97.04μmol/L，48h是59.76μmol/L，72h是33.2

17、0μmol/L。選擇97.04μmol/L的DHA作用細胞24h后，細胞內(nèi)的Caspse-3表達量增高(p＜0.01)，細胞內(nèi)ROS含量也增高。
　　 討論
　　 本研究顯示DHA在體外對U87細胞有明顯的增殖抑制作用，且隨著藥物濃度的升高和作用時間的延長，DHA的作用逐漸增強。利用流式細胞技術(shù)對U87細胞進行周期檢測，發(fā)現(xiàn)DHA作用24h后的U87細胞數(shù)量與對照組比較明顯減少，且細胞多被阻滯于G0-G1期，于S期的U8

18、7細胞較對照組明顯減少。這說明DHA抑制U87細胞增殖的機制之一，是U87細胞阻滯在G0-G1期。因此，我們認為細胞周期調(diào)控是DHA抑制膠質(zhì)瘤細胞增殖的機制之一。
　　 細胞凋亡是由多種基因調(diào)控的細胞程序性死亡過程，和一系列細胞內(nèi)蛋白水解酶的活化有關(guān)。Caspase是一個在細胞凋亡過程中起重要作用的蛋白酶家族。Caspase活化是導(dǎo)致細胞凋亡的中心環(huán)節(jié)，而Caspase-3是細胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)中最關(guān)鍵性的效應(yīng)蛋白酶之一。在調(diào)亡細胞

19、中Caspase-3含量增多。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在使用DHA處理24小時后的U87細胞中，Caspase-3含量較對照組顯著增多，表明DHA誘導(dǎo)U87細胞凋亡與激活caspase通路有關(guān)，其誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細胞凋亡可能是通過caspase-3途徑來實現(xiàn)的。
　　 另外本研究還發(fā)現(xiàn)，在使用DHA處理24小時后的U87細胞內(nèi)ROS含量較對照組亦明顯增多。這也可能是DHA抗腫瘤的作用機制之一。腫瘤細胞與正常的細胞相比具有快速分裂的特點，而快速

20、分裂的腫瘤細胞在復(fù)制DNA的時候需要大量的鐵，因此腫瘤細胞內(nèi)含鐵量比正常細胞高。而青蒿素及其類似物含有一個過氧化物橋結(jié)構(gòu)，它能和亞鐵離子反應(yīng)形成大量活性氧自由基(ROS)。這些自由基在細胞內(nèi)大量形成，對細胞產(chǎn)生毒性作用，引起細胞死亡。由于腫瘤細胞需要大量鐵離子，其細胞表面分布的鐵蛋白受體(TfR)亦遠遠多于正常細胞。因此，我們認為青蒿素及其類衍生物亦能對膠質(zhì)瘤細胞產(chǎn)生選擇性細胞毒作用，而對正常腦細胞作用較小。青蒿素在治療膠質(zhì)瘤時，安全性