雙氫菁蒿素對(duì)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的作用觀察.pdf

1、研究背景
　　 腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，約占顱內(nèi)腫瘤的40％-60％。其中又以膠質(zhì)母細(xì)胞瘤惡性程度最高。由于其呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，單純手術(shù)往往難以根治，術(shù)后復(fù)發(fā)率很高，生存期平均為14個(gè)月。目前，對(duì)于膠質(zhì)瘤患者多采取綜合治療，包括手術(shù)切除、放療和化療。幾十年來，雖然神經(jīng)影像學(xué)技術(shù)和顯微外科技術(shù)取得巨大的進(jìn)步，極大地推動(dòng)了神經(jīng)外科的發(fā)展，但手術(shù)仍難以徹底的切除腫瘤。雖然手術(shù)后輔以放療可以提高膠質(zhì)瘤的治療效果，但由于放射劑

2、量的限制和有相當(dāng)一部分腫瘤對(duì)放療不敏感，大多數(shù)腫瘤出現(xiàn)治療后復(fù)發(fā)的現(xiàn)象。而且，現(xiàn)行的化療藥物由于耐藥性及難以透過血腦屏障等原因亦沒取得理想的療效。
　　 在膠質(zhì)瘤的發(fā)生過程中，一些相關(guān)基因或蛋白出現(xiàn)變化及更改，在不同的信號(hào)途徑對(duì)腫瘤的發(fā)生、細(xì)胞增殖、腫瘤轉(zhuǎn)移或凋亡起著重要作用。如表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR/ErbB(l))基因的過表達(dá)和擴(kuò)增，血小板源生長(zhǎng)因子受體(pla

3、telet-derivedgrowthfactorrecetor，PDGFR)的表達(dá)上調(diào)、控制細(xì)胞周期的INK4A-ARF的缺失、促進(jìn)細(xì)胞凋亡的p53的突變或丟失等等，與腫瘤的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)。而針對(duì)這些基因或蛋白的的基因靶向治療方法大多正處于研究階段，尚未進(jìn)入臨床。目前，化療藥物的輔助治療膠質(zhì)瘤治療，提高生存率仍是的膠治療治療研究的熱點(diǎn)。
　　 青蒿素(Artemisinin)是1971年我國(guó)科學(xué)家從菊科植物黃花蒿的葉和花蕾

4、中分離獲得的一種倍半萜內(nèi)酯過氧化物，其衍生物包括:雙氫青蒿素(DHA)、蒿甲醚、青蒿琥酯等。目前，青蒿素及其衍生物作為高效低毒的抗瘧藥已經(jīng)得到了全世界的公認(rèn)。近10多年來國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)青蒿素及其衍生物對(duì)體內(nèi)外多種細(xì)胞有明顯的誘導(dǎo)凋亡作用，特別是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。因此青蒿素被認(rèn)為具有廣譜抗癌活性。并從青蒿素對(duì)腫瘤細(xì)胞的直接細(xì)胞毒性作用、影響腫瘤細(xì)胞的增殖周期、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡及抗腫瘤血管生成作用等多個(gè)方面，對(duì)青蒿素的抗腫瘤活性機(jī)制時(shí)行

5、研究。
　　 (1)氧自由基介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用。青蒿素作為一種抗瘧疾藥物，其目前公認(rèn)的主要機(jī)制抗瘧疾機(jī)制為:青蒿素類藥物具有過氧化橋的新型倍半萜內(nèi)酯的結(jié)構(gòu)，與亞鐵原子起反應(yīng)后，過氧橋斷裂產(chǎn)生自由基等細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)代謝產(chǎn)物，能引起細(xì)胞死亡。有研究表明，細(xì)胞對(duì)鐵的攝取與細(xì)胞表面的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體有關(guān)。在細(xì)胞分裂時(shí)，DNA復(fù)制需要鐵離子。而腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，分裂活躍，需要大量的鐵離子，故腫瘤細(xì)胞的鐵含量比正常細(xì)胞高出很多。因此，在

6、腫瘤細(xì)胞中鐵含量遠(yuǎn)比正常細(xì)胞多的情況下，青蒿素對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用，遠(yuǎn)大于正常細(xì)胞。這提示了青蒿素作用于腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的ROS遠(yuǎn)多于正常細(xì)胞，對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用更大。可能是青蒿素及其衍生物選擇性抗腫瘤的機(jī)制之一。
　　 (2)細(xì)胞周期阻滯作用。細(xì)胞周期是指細(xì)胞完成一分為二復(fù)制生長(zhǎng)周期。靜止的細(xì)胞，不進(jìn)行分裂活動(dòng)，稱為Go期，周期開始于一個(gè)起始點(diǎn)，由此靜細(xì)胞進(jìn)入G1期，繼之為S期，即DNA合成期，然后進(jìn)入G2期，最后細(xì)胞一分為二，是

7、為M期，即分裂期。細(xì)胞周期有兩個(gè)關(guān)鍵的過渡控制點(diǎn):一在G2/M的交接處，一在G1/S期。許多實(shí)驗(yàn)中觀察到，青蒿素類藥物作用腫瘤細(xì)胞后，細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞周期阻滯現(xiàn)象。而不同部位組織的細(xì)胞，阻滯周期有所不同。這可能是青蒿素對(duì)不同部位腫瘤細(xì)胞的周期阻滯有一定的選擇性。但這種選擇性周期阻滯機(jī)制仍未明確。
　　 (3)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡作用。細(xì)胞調(diào)亡是細(xì)胞程序性死亡。凋亡細(xì)胞出現(xiàn)特殊的形態(tài)改變和DNA裂解，這被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡過程的主要病理學(xué)標(biāo)志

8、。誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的原因及路徑很多。普遍認(rèn)為已明確的細(xì)胞凋亡途徑有兩條。分別是:死亡受體途徑和線粒體途徑。對(duì)于青蒿素誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制，目前在不同組織腫瘤細(xì)胞中的研究結(jié)果出現(xiàn)許多觀點(diǎn)。以HL60細(xì)胞、A549細(xì)胞為模型研究發(fā)現(xiàn)，survivinmRNA和survivin蛋白的表達(dá)均降低。因此，有學(xué)者認(rèn)為ART誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡效應(yīng)的機(jī)制，與IAPs家族成員survivin基因的表達(dá)受抑制有關(guān)。在研究青蒿酯鈉誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞BEL-7402凋亡

9、作用時(shí)，研究人員發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞中p53、p21蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯變化，而bcl-2蛋白表達(dá)水平降低，從而認(rèn)為青蒿素誘導(dǎo)凋亡的分子機(jī)制是p53非依賴性的，與凋亡基因bcl-2下調(diào)有關(guān)。DHA誘導(dǎo)Hela細(xì)胞死亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果，顯示青蒿素誘導(dǎo)凋亡的分子機(jī)制為依賴線粒體途徑的非p53依賴性凋亡。但在結(jié)腸癌細(xì)胞株中，研究者卻認(rèn)為，ART的作用主要是通過P53依賴性與非依賴性途徑介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的。這些不同部位腫瘤細(xì)胞研究結(jié)果顯示，青蒿素誘導(dǎo)不同腫瘤細(xì)胞凋亡

10、的分子機(jī)制存在差異。另外，有學(xué)者研究認(rèn)為，細(xì)胞內(nèi)過氧化橋的激活是細(xì)胞內(nèi)過氧化物導(dǎo)致的細(xì)胞死亡的原因。ART抗肝癌作用機(jī)理與其影響拓?fù)洚悩?gòu)酶介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有關(guān)。此外，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高，引發(fā)的阻斷環(huán)磷酸腺苷介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑有關(guān)。我國(guó)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，DHA可誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡，并伴隨有線粒體形態(tài)改變和caspase-3活化。提示DHA可能通過獨(dú)立caspase-3線粒體死亡途徑，抑制和誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡。目前，關(guān)于青蒿素誘導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞瘤凋亡，

11、特別是誘導(dǎo)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡機(jī)制尚未明確。
　　 (4)抑制血管生成作用。新生血管過度生長(zhǎng)是多種病理過程的主要特點(diǎn)，尤其是腫瘤快速生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的重要基礎(chǔ)。大量實(shí)驗(yàn)證明，多種腫瘤生成、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和愈后均與血管生成密切相關(guān)。血管生成是一個(gè)復(fù)雜的過程，要經(jīng)歷血管內(nèi)皮的增殖和遷移、實(shí)心條索的形成、管壁的膠原沉積以及外周細(xì)胞的形成等多個(gè)步驟才能完成。針對(duì)血管生成過程，進(jìn)行青蒿素抑制新生血管的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，青蒿素能明顯推遲血管新生，減少新生

12、血管數(shù)量。這提示了，青蒿素可能與抑制血管新生的起始步驟，即與血管內(nèi)皮的增殖與遷移、管狀形成有關(guān)。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，青蒿素在瘤血管生成中可抑制VEGF與受體結(jié)合，下調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞上VEGF及其受體表達(dá)。提示ART在抗腫瘤血管生成中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
　　 青蒿素的安全性。青蒿素及其衍生物作為一種廣泛應(yīng)用的抗瘧疾藥，其毒副作用分析在臨床上鮮有報(bào)道。在一項(xiàng)超過一萬(wàn)人臨床試驗(yàn)中，經(jīng)嚴(yán)密觀察，尚未有臨床相關(guān)毒副作用的報(bào)道。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)上，出現(xiàn)的

13、毒性反應(yīng)都是在使用高劑量情況下發(fā)生的。針對(duì)毒副作用的研究顯示，青蒿素及其衍生物的毒副作用，主要包括對(duì)造血系統(tǒng)抑制，胚胎毒性作用，神經(jīng)毒性等。在神經(jīng)毒性方面，主要針對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞，而非膠質(zhì)細(xì)胞。另外，不同部位腦組織青蒿素的敏感性亦存在差異。例如，位于低位腦干的斜方體核、巨細(xì)胞網(wǎng)狀核、與小腦下腳的神經(jīng)元對(duì)蒿甲醚的毒性作用最敏感，而腦皮層神經(jīng)元?jiǎng)t較少受影響。體外研究表明，神經(jīng)毒性呈劑量與時(shí)間依賴性的。另外，有研究發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)青蒿素類藥物肌肉注射比口

14、服毒性更大，酯溶性青蒿素類藥物比水溶性類藥物的毒性大，但這與青蒿素及其衍生物的藥效無(wú)關(guān)。前文提及青蒿素機(jī)制，存在選擇性抗腫瘤作用，而對(duì)正常組織作用較小。因此，我們認(rèn)為青蒿素及其衍生物具有低毒和較高的安全性。具有成為臨床化療藥物的潛在價(jià)值。
　　 本實(shí)驗(yàn)以此為依據(jù)，選擇青蒿素衍生物中作用效果更強(qiáng)的DHA，研究其在不同濃度、不同時(shí)間下觀察其對(duì)U87細(xì)胞的增殖、凋亡的影響，并對(duì)細(xì)胞凋亡的機(jī)制進(jìn)行了初步探討。
　　 目的：探討雙

15、氫青蒿素(DHA)對(duì)人惡性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(U87)增殖和凋亡的影響。
　　 方法：體外培養(yǎng)的U87細(xì)胞，加入不同濃度的DHA(10μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、125μmol/L)分別經(jīng)行培養(yǎng)24h、48h和72h;倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)變化,CCK8藥敏實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖情況;流式細(xì)胞分析細(xì)胞周期變化;Hoechst33258染色觀察細(xì)胞凋亡;Caspse-3活性檢測(cè)及細(xì)胞內(nèi)活性氧(RO

16、S)檢測(cè)。DHA對(duì)U87細(xì)胞增殖的影響，不同濃度與不同時(shí)間的統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析(Univaraiate-ANOVA);兩兩比較方差齊時(shí)采用LSD法，方差不齊時(shí)選用Dunnett'sT3法;對(duì)兩組caspase-3蛋白表達(dá)統(tǒng)計(jì)分析，采用兩獨(dú)立樣本t-test。
　　 結(jié)果：DHA對(duì)U87細(xì)胞具有濃度和時(shí)間依賴性抑制細(xì)胞增殖作用。作用24h后IC50是97.04μmol/L，48h是59.76μmol/L，72h是33.2

17、0μmol/L。選擇97.04μmol/L的DHA作用細(xì)胞24h后，細(xì)胞內(nèi)的Caspse-3表達(dá)量增高(p＜0.01)，細(xì)胞內(nèi)ROS含量也增高。
　　 討論
　　 本研究顯示DHA在體外對(duì)U87細(xì)胞有明顯的增殖抑制作用，且隨著藥物濃度的升高和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，DHA的作用逐漸增強(qiáng)。利用流式細(xì)胞技術(shù)對(duì)U87細(xì)胞進(jìn)行周期檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)DHA作用24h后的U87細(xì)胞數(shù)量與對(duì)照組比較明顯減少，且細(xì)胞多被阻滯于G0-G1期，于S期的U8

18、7細(xì)胞較對(duì)照組明顯減少。這說明DHA抑制U87細(xì)胞增殖的機(jī)制之一，是U87細(xì)胞阻滯在G0-G1期。因此，我們認(rèn)為細(xì)胞周期調(diào)控是DHA抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的機(jī)制之一。
　　 細(xì)胞凋亡是由多種基因調(diào)控的細(xì)胞程序性死亡過程，和一系列細(xì)胞內(nèi)蛋白水解酶的活化有關(guān)。Caspase是一個(gè)在細(xì)胞凋亡過程中起重要作用的蛋白酶家族。Caspase活化是導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的中心環(huán)節(jié)，而Caspase-3是細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)中最關(guān)鍵性的效應(yīng)蛋白酶之一。在調(diào)亡細(xì)胞

19、中Caspase-3含量增多。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在使用DHA處理24小時(shí)后的U87細(xì)胞中，Caspase-3含量較對(duì)照組顯著增多，表明DHA誘導(dǎo)U87細(xì)胞凋亡與激活caspase通路有關(guān)，其誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡可能是通過caspase-3途徑來實(shí)現(xiàn)的。
　　 另外本研究還發(fā)現(xiàn)，在使用DHA處理24小時(shí)后的U87細(xì)胞內(nèi)ROS含量較對(duì)照組亦明顯增多。這也可能是DHA抗腫瘤的作用機(jī)制之一。腫瘤細(xì)胞與正常的細(xì)胞相比具有快速分裂的特點(diǎn)，而快速

20、分裂的腫瘤細(xì)胞在復(fù)制DNA的時(shí)候需要大量的鐵，因此腫瘤細(xì)胞內(nèi)含鐵量比正常細(xì)胞高。而青蒿素及其類似物含有一個(gè)過氧化物橋結(jié)構(gòu)，它能和亞鐵離子反應(yīng)形成大量活性氧自由基(ROS)。這些自由基在細(xì)胞內(nèi)大量形成，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，引起細(xì)胞死亡。由于腫瘤細(xì)胞需要大量鐵離子，其細(xì)胞表面分布的鐵蛋白受體(TfR)亦遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于正常細(xì)胞。因此，我們認(rèn)為青蒿素及其類衍生物亦能對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞產(chǎn)生選擇性細(xì)胞毒作用，而對(duì)正常腦細(xì)胞作用較小。青蒿素在治療膠質(zhì)瘤時(shí)，安全性