缺氧對惡性膠質瘤細胞“干性”的影響及其機制的研究.pdf

1、星形細胞腫瘤是顱內最為常見的原發(fā)性腫瘤之一，占所有顱內原發(fā)性腫瘤的60％以上。盡管采取了包括外科手術及放化療在內的綜合性治療措施，星形細胞瘤的預后仍然很差，膠質母細胞瘤的平均生存時間仍不足一年。越來越多的證據表明，癌癥是一種干細胞疾病。癌癥干細胞，或稱為干細胞樣腫瘤細胞，是腫瘤組織中的一小群具有無限自我更新能力、多向分化潛能的特殊細胞群體。癌癥干細胞具有重要的生物學及治療學意義，它們被認為是腫瘤發(fā)生、演進及復發(fā)的細胞源泉。惡性膠質瘤是最

2、早被證實存在癌癥干細胞的實體腫瘤之一，我們課題組前期亦從腦膠質瘤新鮮組織及已建立的膠質瘤細胞系，如U87及U251細胞中分離得到膠質瘤干細胞并在體外成功培養(yǎng)和鑒定。癌癥干細胞，如同其相對應的成體干細胞一樣，也需要某種特定的微環(huán)境，即niche，以維持其自我更新能力，保持未分化狀態(tài)。
　　缺氧是包括惡性膠質瘤在內的實體腫瘤的基本特征之一。缺氧通過激活多種信號通路，促進細胞存活、增加瘤細胞運動能力、促進腫瘤新生血管化，從而在腫瘤惡性進

3、展中發(fā)揮重要作用。新近有證據表明，缺氧可能是構成膠質瘤干細胞微環(huán)境的關鍵組分之一。缺氧在體外可維持腫瘤干細胞自我更新能力，保持其處于未分化狀態(tài)，但到目前關于缺氧與腫瘤干細胞關系的研究均系體外研究，尚缺乏來自臨床腫瘤樣本的直接證據；此外，缺氧調節(jié)腫瘤干細胞“干性”的分子機制尚缺乏研究。
　　研究目的:
　　1.探討缺氧標記物CA IX在惡性膠質瘤中的表達規(guī)律及表達模式，重點觀測CA IX表達與腫瘤干細胞標志物表達之間的關系；<

4、br>　　2.探討惡性膠質瘤組織中CA IX表達的臨床病理學意義，評價其作為預后指標的應用價值；
　　3.探討缺氧對惡性膠質瘤細胞功能的影響，重點觀測缺氧對細胞形態(tài)、克隆形成、干細胞標志物表達及分化的作用，以證明缺氧可誘導已分化瘤細胞去分化，獲得干細胞特性；
　　4.探討缺氧對膠質瘤干細胞自我更新、分化及干細胞標志物表達的影響，以證明缺氧可維持或增強膠質瘤干細胞“干性”；
　　5.初步探討Notch信號在缺氧誘導的GS

5、Cs“干性”維持或增強中的作用。
　　研究內容和方法:
　　1.缺氧標記物CA IX在惡性膠質瘤中的表達研究：以人惡性膠質瘤組織標本為研究材料，采用免疫激光捕獲顯微切割(i-LCM)、免疫組化及雙標免疫熒光、激光共聚焦顯微術、實時定量PCR等技術，觀測CA IX在惡性膠質瘤中的表達模式，評價其臨床病理學意義及與患者預后的關系，并著重探討CA IX表達與GSCs標志物表達之間的關系。
　　2.缺氧對惡性膠質瘤細胞“干性”

6、調節(jié)的體外研究：以U87、U251細胞系及3例原代培養(yǎng)膠質瘤細胞為研究材料，建立缺氧培養(yǎng)模型，采用透射電鏡觀測瘤細胞超微結構變化；MTT法檢測缺氧對生長的影響；流式細胞術檢測細胞凋亡和細胞周期；Transwell小室檢測細胞遷移；克隆形成實驗檢測瘤細胞克隆形成能力；流式細胞術檢測CD133表達；分別采用實時定量PCR和Western blot檢測干細胞標志物及分化標志物mRNA和蛋白表達。
　　3.缺氧調控膠質瘤干細胞“干性”的體

7、外研究：運用條件培養(yǎng)基壓力篩選的方法從上述膠質瘤細胞中分離培養(yǎng)干細胞樣克隆球，并進行干細胞標志物鑒定；采用干細胞克隆形成實驗和分化實驗分別觀測缺氧對GSCs自我更新及分化的影響；流式細胞術檢測CD133表達；免疫熒光檢測干細胞及分化標志物表達；Western blot檢測干細胞標志物蛋白表達；
　　4. Notch信號通路在缺氧誘導的GSCs“干性”調節(jié)中作用的初步研究：采用Western blot檢測缺氧對GSCs Notch信

8、號關鍵分子表達的影響；以Notch信號特異性抑制劑DAPT處理細胞，檢測其對Notch1的抑制作用，確定合適的濃度(5μg/ml)；采用干細胞克隆形成及分化實驗觀測DAPT對缺氧誘導的GSCs“干性”增強及分化抑制的拮抗作用。
　　研究結果:
　　1.缺氧標記物CA IX在惡性膠質瘤中的表達及其臨床病理學意義：CA IX在惡性膠質瘤中呈過度表達，多表達于高級別膠質瘤壞死灶周邊及低級別膠質瘤侵襲性邊沿的瘤細胞。CA IX表達與

9、腫瘤組織學分級及大小關系密切；CA IX(++)組患者的總體生存期及無疾病進展生存期均顯著低于CA IX(+)及CA IX(-)組患者(p＜0.001)；多因素分析顯示CA IX(++)(p＜0.001)為預后差的獨立預測指標。
　　2.缺氧標記物CA IX表達與干細胞、侵襲標志物表達之間的關系：雙標免疫熒光檢測顯示CA IX陽性區(qū)域表達CD133、Oct4、Sox2及CXCR4的瘤細胞數目均分別顯著高于臨近的CA IX陰性區(qū)域，

10、而CA IX的表達與p53及Ki-67無關；顯微切割獲得的CA IX陽性瘤細胞CA IX、Oct4、Sox2及CXCR4 mRNA水平明顯高于相對應的臨近CA IX陰性瘤細胞。
　　3.缺氧對惡性膠質瘤細胞“干性”調節(jié)的體外研究：缺氧培養(yǎng)條件下，膠質瘤細胞呈現明顯的形態(tài)學變化，總體上是從成熟變得“幼稚”，表現為細胞器減少、膠質纖維絲消失、細胞核仁的出現等；缺氧顯著增強瘤細胞克隆形成能力，增加緊密型克隆形成的比例；缺氧增強瘤細胞的遷

11、移能力；流式細胞檢測顯示缺氧顯著提高CD133陽性細胞比例；缺氧條件下干細胞標志物mRNA及蛋白水平明顯上調，而GFAP表達明顯減弱；總體上缺氧對瘤細胞生長、細胞周期及凋亡的影響并不明顯。
　　4.缺氧調控膠質瘤干細胞“干性”的體外研究：采用條件培養(yǎng)基壓力篩選成功獲得膠質瘤干細胞克隆球，后者高表達干細胞標志物；缺氧培養(yǎng)下，GSCs克隆球形成比例及大小均明顯增加，而克隆球向膠質細胞的分化明顯受抑；缺氧培養(yǎng)使得GSCs CD133陽性

12、細胞比例明顯增高，干細胞標記物Oct-4及Sox-2蛋白表達上調。
　　5. Notch信號通路在缺氧誘導的GSCs“干性”調節(jié)中的作用：缺氧處理后GSCs Notch信號關鍵分子(Notch1，Notch1 ICD，Hes-1)蛋白表達明顯上調；以DAPT處理后，GSCs Notch1蛋白水平顯著下降，呈現梯度依賴性，5ug/ml DAPT對Notch1蛋白表達的抑制率達80％；以5ug/ml DAPT處理各組GSCs，可顯著抑

13、制缺氧對GSCs克隆形成增強的誘導作用，降低克隆形成數目，形成的克隆體積也明顯縮小。同時可部分抵消缺氧誘導的GSCs分化抑制作用。
　　結論:
　　1.缺氧標志物CA IX在惡性膠質瘤過度表達，其高表達意味著較高的組織學分級及預后不良，CA IX介導的腫瘤惡性進展可能與瘤細胞“干性”增強及侵襲力的增加有關；
　　2.我們首次證實了在惡性膠質瘤組織中CA IX陽性區(qū)域存在更多干細胞樣表型的瘤細胞，而且切割的CA IX(+