復(fù)肝春6號誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：原發(fā)性肝癌是我國最常見的癌癥之一，同時又是最難治療的癌癥之一。統(tǒng)計資料表明，全世界每年約45％新發(fā)病的肝癌病例在我國大陸。由于其起病隱匿，早期缺乏典型癥狀，一旦發(fā)現(xiàn)多已進(jìn)入中晚期，預(yù)后極差。近20年來肝癌的病死率呈現(xiàn)上升趨勢，我國肝癌的總體五年生存率為2.7％，肝癌已成為我國第二位惡性腫瘤致死原因。由于我國數(shù)量可觀的人群有HBV/HCV感染等肝癌發(fā)生的背景，新世紀(jì)我國肝癌高發(fā)的形勢仍將十分嚴(yán)峻。 目前臨床對肝癌的治療主要采

2、取手術(shù)、放射治療和藥物化療的方法。手術(shù)治療，迄今仍被認(rèn)為是肝癌的首選療法，其療效的好壞除與腫瘤因素有關(guān)外，還與肝功能情況以及健康狀況密切相關(guān)。肝癌根治性切除術(shù)術(shù)后5年復(fù)發(fā)率為61.5％，即單靠手術(shù)治療并不能完全切除癌腫和防止肝癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，而且往往給患者帶來身體上的痛苦；放射治療可使患者產(chǎn)生骨髓抑制、消化道反應(yīng)、免疫力下降等嚴(yán)重不良反應(yīng)；化療是目前治療肝癌最常用的方法，但是它對腫瘤細(xì)胞的選擇性抑制作用不強(qiáng)，全身用藥毒副性較大。以上各種

3、治療方法均給機(jī)體帶來了不同程度的損傷，如何提高肝癌治療的總體療效，已成為醫(yī)學(xué)界探討的熱點(diǎn)問題。 隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，具有我國傳統(tǒng)特色的中醫(yī)藥在肝癌治療中顯示了無可比擬的優(yōu)勢。而細(xì)胞凋亡又是調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞生長速率的重要方式，自八十年代以來，人們越來越認(rèn)識到，很多腫瘤不僅細(xì)胞增殖率很高，而且其細(xì)胞死亡速率很低，即是由細(xì)胞增殖與死亡平衡失調(diào)造成的。在腫瘤組織中，通?？梢钥吹絻煞N細(xì)胞死亡的形式，即壞死性細(xì)胞死亡和細(xì)胞凋亡。后者是由于外因或

4、內(nèi)因的作用引起細(xì)胞自殺造成的，腫瘤細(xì)胞的增殖率與細(xì)胞凋亡速率處于一種相對平衡狀態(tài)，此平衡狀態(tài)決定著腫瘤生長速率。因此通過人為的直接或間接干預(yù)而改變腫瘤組織的內(nèi)環(huán)境，打破腫瘤自身形成的細(xì)胞增殖與凋亡的平衡態(tài)，進(jìn)而使腫瘤細(xì)胞發(fā)生增殖逆轉(zhuǎn)，也就是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，已成為腫瘤治療研究的新途徑。其基本特點(diǎn)不是直接殺傷腫瘤細(xì)胞，而是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。自從1992年Dive提出將誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡作為以后腫瘤治療研究中的主要目標(biāo)與手段，至今誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞

5、凋亡已成為國際腫瘤治療中的研究熱點(diǎn)。我國學(xué)者近幾年來，即已開始進(jìn)行中藥誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的研究?，F(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)與中藥方劑治療腫瘤相結(jié)合的研究是揭示中醫(yī)治療腫瘤機(jī)理的主要措施。已有資料表明，在實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)一些中藥提取物及復(fù)方中藥在體外及體內(nèi)抗腫瘤治療試驗(yàn)中可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，并可影響腫瘤細(xì)胞的某些基因表達(dá)變化。 本實(shí)驗(yàn)采用由河北省中醫(yī)院毛宇湘主任醫(yī)師根據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)擬定的復(fù)肝春6號(FGC-6)方劑，觀察了FGC-6體外誘

6、導(dǎo)肝癌H22細(xì)胞凋亡的作用，目的在于從細(xì)胞水平、分子水平探討該方劑抗肝腫瘤作用的機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。 方法：將FGC-6制成水煎劑，過濾，最后用微孔濾膜過濾除菌。藥物濃度以生藥計。FGC-6對肝癌H22 細(xì)胞的半數(shù)致死量濃度確定和抑制率試驗(yàn)設(shè)6個組，每組8個重復(fù)。采用96孔板培養(yǎng)，將小鼠肝癌H22細(xì)胞濃度調(diào)整為1×10<'5>個/ml，每孔加入150μl，37℃、5％CO<,2>飽和水汽細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 小時后，

7、陽性對照5-Fu組加入5-Fu(50ug/ml)50μl。正常對照NS組加入培養(yǎng)液50μl。FGC-Ⅰ組加入300 mg/ml藥物50μl。FGC-Ⅱ組加入200 mg/ml藥物50μl。FGC-Ⅲ組加入100mg/ml藥物50μl。FGC-Ⅳ組加入50 mg/ml藥物50μl。共同培養(yǎng)24小時后，測定其OD<,492>，求其平均值，計算半數(shù)致死量和抑制率。生長曲線法檢測藥物對體外培養(yǎng)H22細(xì)胞增殖抑制作用試驗(yàn)分為5個組，其中3個藥物濃

8、度組(mg/ml)，分別為FGC-Ⅰ組(480 mg/ml)、FGC-Ⅱ組 (240 mg/ml為半數(shù)致死量濃度)、FGC-Ⅲ組(120mg/ml)和陽性對照5-Fu(50ug/ml)組、正常對照(NS)組。每組21個重復(fù)。按上述方法培養(yǎng)24小時后，分別加入不同濃度的藥物。共同培養(yǎng)，每隔24小時收獲一次，每天每組收獲3孔，混勻后用臺盼藍(lán)染色計算活細(xì)胞數(shù)。取平均值，連續(xù)檢測7天。以每ml拒染的活細(xì)胞數(shù)與培養(yǎng)時間作圖繪制生長曲線。

9、 另將試驗(yàn)設(shè)4個組，其中2個FGC-6藥物濃度組，分別為FGC-Ⅰ組(480 mg/ml)、FGC-Ⅱ組(240 mg/ml)。和陽性對照5-Fu(50ug/ml)組、正常對照NS組。調(diào)整小鼠肝癌H122細(xì)胞濃度為1×10<'5>個/ml，取7.5 ml于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，37℃、5％CO<,2>飽和水汽二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱中培育24小時后，分別加入不同濃度的藥物以及對照液各2.5 ml。共同培養(yǎng)48小時后，收獲細(xì)胞進(jìn)行DNA ladder分

10、析、細(xì)胞周期及凋亡率和超微形態(tài)結(jié)構(gòu)分析。對癌細(xì)胞的凋亡進(jìn)行多方面、多角度的分析，以進(jìn)一步探討腫瘤細(xì)胞凋亡的發(fā)生機(jī)制。 結(jié)論： 1.復(fù)肝春6號對體外培養(yǎng)H22細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用。 2.復(fù)肝春6號可以使體外培養(yǎng)的H22細(xì)胞染色體DNA在核小體連接處斷裂，造成DNA損傷，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡。 3.復(fù)肝春6號可將體外培養(yǎng) H22細(xì)胞阻滯在細(xì)胞周期的G1/G0期。使細(xì)胞增殖分化受到抑制，出現(xiàn)細(xì)胞凋亡。