肝干細(xì)胞和肝癌細(xì)胞β-catenin蛋白表達(dá)及誘導(dǎo)分化的實驗研究.pdf

1、目的： 1.摸索較為經(jīng)濟(jì)實用的肝干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定分析方法。通過建立大鼠肝卵圓細(xì)胞的增殖模型，采用膠原酶消化法分離卵圓細(xì)胞，再經(jīng)過Percoll密度梯度離心純化，分離出肝卵圓細(xì)胞。進(jìn)行培養(yǎng)和肝干細(xì)胞標(biāo)志物鑒定，期望得到下步試驗所需要的肝干細(xì)胞，進(jìn)一步研究肝干細(xì)胞定向誘導(dǎo)向肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞分化的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化規(guī)律。 2.通過對wnt信號途徑的關(guān)鍵分子β-catenin在肝干細(xì)胞和肝癌細(xì)胞的表達(dá)及細(xì)胞內(nèi)分布的比較，研究w

2、nt信號在肝干細(xì)胞和肝癌細(xì)胞分布的差異及其對細(xì)胞增殖、分化作用的關(guān)系。證實wnt信號途徑對肝卵圓細(xì)胞增殖及分化的調(diào)控作用。 3.通過肝干細(xì)胞和肝癌細(xì)胞在誘導(dǎo)分化前后細(xì)胞形態(tài)、生長曲線、細(xì)胞分泌白蛋白和AFP功能變化，及β-catenin分布的差異比較，研究β-catenin在肝干細(xì)胞和肝癌細(xì)胞增殖和分化中發(fā)揮的作用。 方法： 用AAF/PH建立了大鼠肝卵圓細(xì)胞增殖模型，用膠原酶消化法自大鼠AAF/PH模型中分離單

3、個肝卵圓細(xì)胞，經(jīng)過Percoll梯度離心純化肝卵圓細(xì)胞懸液，細(xì)胞懸液接種于0.2％明膠處理的含10％胎牛血清和含SCF20ng/ml，HGF10ng/ml，EGF10ng/ml，LIF10ng/ml的DMEM/F12培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶進(jìn)行增殖培養(yǎng)。新分離的肝卵圓細(xì)胞用免疫熒光和WesternBlotting檢測c-kit干細(xì)胞抗原，RT-PCR法檢測其CK19和白蛋白抗原，對肝卵圓細(xì)胞進(jìn)行鑒定。采用免疫細(xì)胞化學(xué)，免疫組織化學(xué)和Western

4、:Blotting技術(shù)檢測β-catenin在肝干細(xì)胞和肝癌細(xì)胞的表達(dá)及其細(xì)胞膜、細(xì)胞漿和細(xì)胞核分布，比較肝干細(xì)胞和肝癌細(xì)胞表達(dá)和細(xì)胞內(nèi)分布的差異性。用含生長因子SCF20ng/ml，HGF10ng/ml，EGF10ng/ml，地塞米松1.0×10-7mol/L，1.5％DMSO，HSS20ng/ml的誘導(dǎo)培養(yǎng)液對進(jìn)行肝干細(xì)胞及肝癌細(xì)胞株的誘導(dǎo)分化，觀察誘導(dǎo)分化前后兩種細(xì)胞形態(tài)變化和β-catenin表達(dá)和細(xì)胞表達(dá)及分布的變化。

5、 結(jié)果： 1.成功制造了大鼠AAF/PH肝卵圓細(xì)胞增殖模型，部分肝切除手術(shù)后11-12d取肝，經(jīng)過膠原酶Ⅳ消化肝組織和Percoll梯度離心肝細(xì)胞懸液等相對簡單的方法提純肝卵圓細(xì)胞，所得細(xì)胞存活率90％，細(xì)胞數(shù)1.0×105～1.0×106/ml。新分離的肝卵圓細(xì)胞大小基本均勻，為卵圓形，其直徑相當(dāng)于成熟肝細(xì)胞1/4～1/6。免疫熒光技術(shù)和免疫印跡分析顯示新分離的肝卵圓細(xì)胞有c-kit抗原表達(dá)，而成熟的肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞就無明顯的

6、c-kit蛋白表達(dá)。RT-PCR分析顯示，成熟的肝細(xì)胞僅表達(dá)白蛋白mRNA，膽管上皮細(xì)胞僅表達(dá)CK19的mRNA，而新分離的肝卵圓細(xì)胞表達(dá)CK19和白蛋白基因mRNA，提示肝干細(xì)胞具有干細(xì)胞標(biāo)志和成熟的肝細(xì)胞及膽管上皮細(xì)胞的標(biāo)志，具有兩種分化的潛能。我們采用的AAF喂養(yǎng)大鼠方法、肝組織取材和消化、梯度離心和肝卵圓細(xì)胞培養(yǎng)方法與前人都有有明顯的改進(jìn)。 2.免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示W(wǎng)B大鼠肝干細(xì)胞、L2肝細(xì)胞、SMCC-7721和Hep

7、G2人肝癌細(xì)胞胞膜和胞漿均有β-catenin表達(dá)，而傳統(tǒng)的免疫組化對細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)不易分辨清楚。我們首次采用WesternBlotting檢測四種細(xì)胞株和新分離的肝卵圓胞漿和胞核β-catenin，發(fā)現(xiàn)五種細(xì)胞胞漿均有明顯β-catenin表達(dá)，HepG2和SMCC-7721肝癌細(xì)胞株灰色條帶較深，而肝細(xì)胞和肝干細(xì)胞灰色條細(xì)而淺，肝卵圓細(xì)胞漿只有少量β-catenin表達(dá)。HepG2和SMCC-7721細(xì)胞胞核β-catenin表達(dá)明顯

8、，核內(nèi)條帶灰度甚至比細(xì)胞漿高，而WB和L2肝細(xì)胞僅有少量表達(dá)，肝卵圓細(xì)胞核內(nèi)未檢測到β-catenin積聚，提示肝癌細(xì)胞漿和細(xì)胞核有β-catenin較高表達(dá)。 20例肝癌組織β-catenin免疫組化染色顯示細(xì)胞膜、細(xì)胞漿均有不同程度表達(dá)，與正常組織和肝硬化的組織相比，有三個顯著特點： ①肝癌細(xì)胞膜β-catenin表達(dá)量明顯減少，胞膜分布不連續(xù)，甚至缺如，細(xì)胞間界限不清楚； ②細(xì)胞漿內(nèi)明顯的β-catenin

9、過表達(dá)，且細(xì)胞漿分布不均勻。 ③隨肝癌分化程度不同，β-catenin表達(dá)也有明顯差異，高分化肝癌細(xì)胞膜β-catenin分布較為清楚連續(xù)，細(xì)胞間有界限，細(xì)胞漿表達(dá)量較多，分布均勻。中度分化的肝癌細(xì)胞膜和細(xì)胞漿內(nèi)β-catenin分布界與高低分化之間。低分化肝癌，β-catenin在細(xì)胞膜表達(dá)較少，細(xì)胞界限不清楚，細(xì)胞漿β-catenin分布不均勻，呈點狀積聚。 WesternBlotting檢測肝癌細(xì)胞核β-caten

10、in表達(dá)情況，結(jié)果顯示，正常組織細(xì)胞漿有β-catenin表達(dá)，而細(xì)胞核未見明顯的β-catenin表達(dá)，灰色條帶不明顯，而且6例肝癌組織(其中1例為低分化肝癌)細(xì)胞漿和細(xì)胞核β-catenin表達(dá)均較為明顯，核內(nèi)β-catenin條帶灰度甚至比細(xì)胞漿高，結(jié)果提示肝癌細(xì)胞漿β-catenin過表達(dá)和胞核β-catenin積聚。 3.從HepG2、SMCC-7721和WB細(xì)胞株誘導(dǎo)前后細(xì)胞生長曲線的變化看，相同時間內(nèi)誘導(dǎo)劑使細(xì)胞增

11、殖提高1倍，而且在前五天生長較快。WB肝干細(xì)胞株在誘導(dǎo)后第3d、5d、7d產(chǎn)生白蛋白較HepG2細(xì)胞高(P＜0.01、P＜0.05、P＜0.05)，第5d產(chǎn)生白蛋白較SMCC-7721細(xì)胞高(P＜0.05)，然而，這三種細(xì)胞在誘導(dǎo)期細(xì)胞株產(chǎn)生AFP的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。誘導(dǎo)后HepG2、SMCC-7721和WB細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)不同程度的變化，細(xì)胞變?yōu)槎嘈涡曰蜷L梭狀，但始終未見象肝卵圓細(xì)胞那樣分化產(chǎn)生成熟的肝細(xì)胞。免疫細(xì)胞化學(xué)顯

12、示誘導(dǎo)前后三種細(xì)胞株β-catenin的表達(dá)及胞膜、胞漿分布無明顯變化。新分離的肝卵圓細(xì)胞誘導(dǎo)分化第3d出現(xiàn)成熟的肝細(xì)胞，第5d出現(xiàn)類似膽管樣的長梭形細(xì)胞。隨著時間延長，肝干細(xì)胞數(shù)目逐漸減少，成熟的肝細(xì)胞增多，后期樹突樣膽管細(xì)胞為主。新分離的肝卵圓細(xì)胞加氯化鋰后，第3d肝卵圓細(xì)胞增殖加快，分化為成熟肝細(xì)胞數(shù)目較未加氯化鋰者少。WesternBlotting檢測三種細(xì)胞株胞漿和胞核β-catenin表達(dá)條帶灰度與誘導(dǎo)前相近，肝卵圓細(xì)胞漿有

13、少量表達(dá)，胞核未見明顯β-catenin表達(dá)條帶。提示誘導(dǎo)分化劑對于三種細(xì)胞株，不象肝卵圓細(xì)胞那樣分化明顯，只是細(xì)胞形態(tài)和增殖速度的變化。兩種檢測結(jié)果提示對于增殖較快的細(xì)胞株和肝癌細(xì)胞，β-catenin在胞漿和胞核有較高的表達(dá)和分布，而較易分化的肝卵圓細(xì)胞胞漿表達(dá)β-catenin量少，胞核無明顯β-catenin積聚。 結(jié)論： 1.本研究成功制造了大鼠AAF/PH肝干細(xì)胞增殖模型，建立了利用簡單實用分離肝干細(xì)胞的方法

14、。不僅注意到肝干細(xì)胞直徑只有成熟肝細(xì)胞的1/4～1/6，其具有干細(xì)胞的標(biāo)志，具有成熟肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞的標(biāo)志，即有向兩個方向分化的潛能，而且經(jīng)過誘導(dǎo)培養(yǎng)更清楚的觀察到肝卵圓細(xì)胞分化成肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞的細(xì)胞體積和形態(tài)的變化過程。 2.本實驗使用westernblotting方法檢測細(xì)胞漿和胞核β-catenin表達(dá)，比免疫組化更精確和直觀，結(jié)合免疫組化對細(xì)胞膜和胞漿β-catenin表達(dá)，更準(zhǔn)確檢測細(xì)胞膜、細(xì)胞漿和細(xì)胞核分布。肝干細(xì)

15、胞和肝癌細(xì)胞在β-catenin表達(dá)和細(xì)胞內(nèi)分布具有明顯差異，肝干細(xì)胞胞膜分布均勻連續(xù)，胞漿有少量表達(dá)，胞核內(nèi)沒有積聚。而癌細(xì)胞胞膜β-catenin分布不均勻、不連續(xù)甚至缺如，細(xì)胞分化越差胞膜β-catenin分布越少，肝癌細(xì)胞漿存在β-catenin過度表達(dá)，胞核內(nèi)β-catenin積聚非常明顯。這種細(xì)胞β-catenin分布的差異決定其生物學(xué)行為的不同，肝癌胞膜β-catenin分布越少可能與癌細(xì)胞易肝內(nèi)血行轉(zhuǎn)移有關(guān)，胞核內(nèi)β-c

16、atenin積聚使癌細(xì)胞增殖快，分化不良等癌高度惡性可能有聯(lián)系。研究結(jié)果提示β-catenin在肝干細(xì)胞和肝癌細(xì)胞表達(dá)和細(xì)胞內(nèi)分布與其增殖速度和分化程度有很大關(guān)系。 3.肝卵圓細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生成熟肝細(xì)胞和膽管上皮樣細(xì)胞，分化過程中干細(xì)胞具有體積由小到大，細(xì)胞形態(tài)也有較大改變的過程。對此過程的認(rèn)識，有利于肝癌可能起源于肝干細(xì)胞理解，這與過去認(rèn)為肝癌起源于體積大而成熟的肝細(xì)胞有很大差異。肝卵圓細(xì)胞存在β-catenin表達(dá)，氯化鋰可使

17、肝卵圓細(xì)胞增值加快，分化卻受到抑制，證實了肝干細(xì)胞同樣存在β-catenin信號途徑，而且也可能調(diào)控肝干細(xì)胞的增殖和分化。 4.從某些方面看，肝干細(xì)胞和肝癌細(xì)胞β-catenin蛋白表達(dá)有差異，也有共性。肝干細(xì)胞株具有永生性生長的能力，誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液中多種細(xì)胞生長因子通過其相應(yīng)受體激活胞漿β-catenin信號，促進(jìn)細(xì)胞的增殖。肝干細(xì)胞株增殖速度較快，具有癌細(xì)胞的胞漿和胞核β-catenin積聚的特征，所不同的是細(xì)胞膜分布均勻連