腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導配體誘導肝癌細胞凋亡的實驗研究.pdf

1、浙江大學碩士學位論文腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導配體誘導肝癌細胞凋亡的實驗研究姓名：周慧明申請學位級別：碩士專業(yè)：內(nèi)科學（傳染病學）指導教師：陳智2003.5.1浙江大學碩士學位論文胎牛血清的培養(yǎng)液至I ∞“I 培養(yǎng)1 2 小時后，吸去上清后加1 0 0 “l(fā) 的無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)1 2小時后加不同濃度的T R A I L ( 5 0 n g ／m l ，l O O n g ／m l ，2 0 0 n g ／m l ，4 0 0 n g ／

2、m l ，8 0 0 n g ／m l ，1 6 0 0 n g ／m 1 ) 及其選擇合適的劑量與亞毒性劑量的化療藥( 阿霉素0 ．1 U g ／m l ，絲裂霉素l 腿／m 1 及5 一F U0 ．1 p 。g ／m 1 ) 聯(lián)合應(yīng)用，C a s p a s e - 9 抑制劑( 2 0 P M ) 和拉米夫定0 ．2 1 1 9 ／1 ，用無血清的培養(yǎng)液加至1 0 0 “l(fā) ，培養(yǎng)1 8 小時后加入2 0 P - 1 的M T T

3、 ，與M T T 共孵育4 小時后0 ．D 5 7 0 r m 檢測。酶標儀上測出0 ．D 5 7 0 n m 值，細胞殺傷率= [ ( 卜實驗組光吸收值／對照組光吸收值) ] X 1 0 0 ，重復三次，得出量效關(guān)系曲線。2 ) 凋亡分析：使用c A L T A GL a b o r a t o r i e s 公司A n n e x i n V 試劑盒檢測。2 m I 培養(yǎng)液含有4 x i 0 5 細胞培養(yǎng)于1 2 孔板，加含有1

4、0 ％胎牛血清的培養(yǎng)液至1 0 0 ul 培養(yǎng)1 2小時后，吸去培養(yǎng)液加1 0 0 “l(fā) 的無血清1 6 4 0 培養(yǎng)液培養(yǎng)】2 小時后加不同濃度T R A I L( 0 ，5 0 n g ／m l ，l O O n g ／m l ，2 0 0 n g ／m l ，4 0 0 n g ／m l ，8 0 0 n g ／m l ，1 6 0 0 n g ／m 1 ) 及其選擇合適的劑量與亞毒性劑量的化療藥( 阿霉素0 ．1 №／m l ，

5、絲裂霉素I P - g ／m l 及5 一F U0 ．1 l | t g ／m I ) 聯(lián)合應(yīng)用，用無血清的培養(yǎng)液加至2 m l ，1 2 小時后，采用流式細胞儀( F c M ) A n n e x i n V - F I T C 和碘化丙啶( P I )熒光染色分析其誘導凋亡活性，碘化丙啶( P I ) 和A n n e x i n V 均陰性為活細胞，P I 陰性，A n n e x i nV 陽性為早期凋亡細胞，碘化丙啶( P

6、I ) 和A n n e x i n V 均陽性為晚期凋亡細胞。3 ) 藥物抑制實驗：1 x 1 0 3 ／m l H e p G 2 ．2 ．1 5 細胞接種2 4 孔細胞培養(yǎng)板，每孔i m l ，3 7 “ ( 2 、5 ％C 0 2 飽和濕度的條件下培養(yǎng)2 4 h ，加入0 ．2 1 1 9 ／1 拉米夫定，同時設(shè)細胞對照，每2 4 h 換原濃度藥液及對照培養(yǎng)液一次t 3 d 后收集培養(yǎng)液，一2 0 “ C 冰凍保存待測。4 )

7、抗原抑制實驗：用H B e A g 和t l B s A g 固相放射免疫檢測試劑盒測定H B e A g 和H B s A g 的滴度。測定每孔c p m 值，三個平行孔取均值后，計算抑制率?？乖种坡? ％) = [ ( 細胞對照c p m 值一給藥組c D m 值) ／細胞對照c p m 值] ×1 0 0 。5 ) H B VD N A 檢測：加入拉米夫定及對照的H e p G 2 ．2 ．1 5 細胞的上清液經(jīng)深圳匹

8、基公司H B VD N A熒光定量試劑盒抽提后，用R o c h e 公司的L i g h t c y c l e 熒光定量儀檢測D N A 的拷貝數(shù)。6 ) 統(tǒng)計分析：細胞活性分析采用非線性模型，卡方檢驗得出P 值，所有實驗結(jié)果均采用S P S S1 0 ．0 統(tǒng)計軟件，進行統(tǒng)計分析。結(jié)果：1 lT R A I L 誘導細胞株的凋亡：人重組T R A I L 對肝癌細胞株及人正常肝細胞L 0 2殺傷的量一效關(guān)系成正比，T R A I

9、L I O O n g ·m l 。殺傷率約1 0 ％。1 6 0 0 r i g ·m 1 1 殺傷率為6 5 牝A 上。而轉(zhuǎn)染H B V 的H e p 6 2 ．2 ．1 5 細胞，加入不周濃度的T R A I L 后，殺傷率維持在1 0 ％左右，而肝癌細胞／- ／e p G 2 在不同濃度的T R A I L 的作用下，T R A I L 2 0 0 n g ／m l 可見凋亡峰，凋亡率為1 8 ．8 3 ％，