徐長卿誘導(dǎo)人肝癌細胞HepG-2凋亡的實驗研究.pdf

1、目的:觀察徐長卿體外誘導(dǎo)人肝癌細胞系HepG-2細胞凋亡，初步探討徐長卿的分子作用機制，為徐長卿治療肝癌尋找實驗依據(jù)。 方法:采用細胞藥理學(xué)方法研究徐長卿HepG-2細胞凋亡及凋亡相關(guān)調(diào)控基因等指標的影響。主要觀察指標及方法如下： 1.徐長卿對HepG-2細胞的毒性作用實驗： 用0.06％胰蛋白酶將HepG-2細胞分散成單個細胞懸液，用完全培養(yǎng)液制成濃度為3×10<'5>個/ml的細胞懸液，按0.1ml/孔接種于

2、96孔板，置37℃、飽和濕度、5％CO<,2>培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待細胞貼壁2d后換含藥培養(yǎng)液0.01ml/孔，每個濃度3孔。將徐長卿水提物原液作系列倍比稀釋成以八個濃度：50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39g/L；將徐長卿醇提物原液作系列倍比稀釋成以下七個濃度50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78g/L，置37℃、飽和濕度、5％CO<,2>培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，并設(shè)不加藥物的對照；12d后

3、去掉上清，所余細胞用MTT法測藥物對細胞毒性。 2.徐長卿對HepG-2細胞生長曲線的影響： 取對數(shù)生長期細胞用10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液配成細胞數(shù)為1×lO<'4>/ml的細胞懸液，在24孔培養(yǎng)板中接種，每孔1ml。細胞貼壁后，加入含徐長卿水提物濃度為22g/L和11g/L和徐長卿醇提物稀濃度為11g/和5.5g/L的維持培養(yǎng)基，同時設(shè)正常對照組繼續(xù)培養(yǎng)。在培養(yǎng)的第1、2、3、4、5、6、7天，各取樣4孔，消化細胞

4、后加入臺盼蘭染液計活細胞數(shù)，并與培養(yǎng)時間作圖。 3.徐長卿水提物對HepG-2肝癌細胞周期的影響： 處于指數(shù)生長期的細胞，胰酶消化后制成均勻細胞懸液，臺盼藍染色計數(shù)。當活細胞率大于95％，進行實驗。①將細胞懸液用完全培養(yǎng)基稀釋至10<'6>/ml，接種于50cm<'2>培養(yǎng)瓶中，每瓶5ml，于37℃，5％CO<,2>、飽和濕度條件下培養(yǎng)24小時，然后進行處理。②藥物組，培養(yǎng)液中加入徐長卿水提物終濃度為22g/L、11g/

5、L，同時做正常細胞對照。作用時間為48小時，每組3瓶。DNA染色：棄去培養(yǎng)液，細胞用。Hanks液洗2遍，0.06％胰酶消化3分鐘，輕輕吹打成細胞懸液，300g離心5分鐘，去上清，將細胞重懸于1ml冷乙醇中，并輕輕吹打，4℃固定，固定時間大于24小時。固定后離心，300rpm，5分鐘，去上清，加入50 μg/ml的RNA酶1ml，輕輕吹打，室溫避光30分鐘，除去細胞內(nèi)RNA。然后300 rpm，5分鐘再離心，去上清，加入60μg/ml的

6、PI 1ml，輕輕吹打，室溫避光30分鐘。FACS檢測：樣品最后上機進行FACS檢測。用ModFit軟件分析，統(tǒng)計出各時相細胞的百分比。 4.徐長卿提取物對HepG-2肝癌細胞凋亡的影響： 4.1 DNA梯度電泳(DNA Ladder)觀察DNA降解片段：DNA提?。核幬锝M和正常細胞組的細胞在培養(yǎng)48hr后，常規(guī)抽提DNA。 檢測方法：運用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA Ladder． 結(jié)果判斷：正?；罴毎鸇N

7、A顯基因組條帶位于加樣孔附近，壞死細胞由于其DNA的不規(guī)則降解顯一條連續(xù)的膜狀條帶，凋亡細胞的DNA則因為DNA降解為180bp或其多聚體組成的寡核苷酸片段顯“梯狀(1adder)"條帶。 4.2 流式細胞術(shù)觀察徐長卿提取物對HepG-2肝癌細胞凋亡的影響： HepG-2細胞的培養(yǎng)及處理：取對數(shù)生長期的細胞，0.06％胰酶消化后制成單細胞懸液O.4％臺盼藍染色，計算活細胞率為97.5％。將細胞懸液接種至50cm<'2>培

8、養(yǎng)瓶中，10<'6>個細胞/瓶，在37℃，5％Co<,2>、飽和濕度條件下培養(yǎng)24小時后，加入含藥培養(yǎng)基。藥物組：每瓶培養(yǎng)液5ml中加入徐長卿水提物終濃度為22g/L、11g/L；對照組加入等量2％DMEM。加藥后于24小時、48小時每個時間點各取3瓶細胞，進行檢測。凋亡細胞的檢測：小心棄掉培養(yǎng)液，0.06％胰酶消化3分鐘，輕輕吹打細胞成單細胞懸液，1000r/min離心10分鐘，Bindihg Buffer重懸細胞至l×10<'6>/

9、ml，取100ul細胞懸液至5ml FACS管中，加入5 μl Annexin V-FITC，10μl F混勻，室溫下避光孵育15分鐘后每管加入400ul BindirBuffer，1小時內(nèi)上機進行流式細胞分析。同時染對照管(主細胞)和補償設(shè)置管，即未染色的細胞，單染Annexin V-FIT的管和單染PI的管FCM流式細胞術(shù)分析：采用ALTRA型流式細胞儀，488nm激發(fā)光源。先將對照管上樣，通過調(diào)整參數(shù)FSC和SSC，在散射光點圖(

10、FSC/SSC)中清獲顯示出一個清晰、集中的細胞群體，對細胞群體進行設(shè)門(Gate)，再以門中細胞進行后續(xù)熒光信號檢測。將對照管(裸細胞)的熒光強度設(shè)定為非特異性本底熒光，并在此基礎(chǔ)上確定陽性熒光表達比率。調(diào)定流式細胞儀，使熒光散入圖中裸細胞集中分布在左下象限。保持FLl、FL2、FL3不變分別將單染AV-FITC的管和單染PI的管上樣，調(diào)整儀器熒光補償值，進行光譜重疊校正后即可分析樣本。每個樣本上獲取10，000個細胞，采用CellQ