TLR7介導(dǎo)單鏈RNA病毒的天然免疫及病毒疫苗的研究.pdf

1、識(shí)別并抵抗微生物的感染對于多細(xì)胞生物的生存是必須的。天然免疫應(yīng)答是機(jī)體防御感染性疾病的第一防線,在天然免疫中,由于病原體不斷地進(jìn)化、突變會(huì)使識(shí)別的有效性逐步減弱。所以,對于宿主而言最大的挑戰(zhàn)在于通過有限的受體迅速識(shí)別大量不同的病原體并作出應(yīng)答。 對Toll樣受體(TLRs)及病原相關(guān)的分子模式(PAMPs)的發(fā)現(xiàn)徹底改變了這一看法。作為最具有代表性的模式識(shí)別受體,TLRs對PAMPs進(jìn)行識(shí)別,引發(fā)的信號(hào)傳導(dǎo)導(dǎo)致炎癥介質(zhì)的釋放,在

2、天然免疫防御中起重要作用,并且最終激活獲得性免疫系統(tǒng),因此TLRs控制著天然免疫和獲得性免疫。 近年來,越來越多的證據(jù)表明TLRs參與了天然免疫系統(tǒng)對病毒的識(shí)別,在抗病毒感染中發(fā)揮了重要的作用。病毒是一種相對簡單的生物,由衣殼蛋白包裹核酸(DNA或RNA)組成。TLR4首先被發(fā)現(xiàn)可識(shí)別呼吸道合胞體病毒(RSv)的F蛋白并介導(dǎo)激活單核細(xì)胞。特別是最近的研究發(fā)現(xiàn),對于病毒的核酸成分,除了提供遺傳信息以外,還能夠被TLR3、TLR9、

3、TLR7/8這一類表達(dá)于細(xì)胞內(nèi)體的TLRs所識(shí)別,誘導(dǎo)天然免疫反應(yīng)并通過分泌的細(xì)胞因子控制獲得性免疫的生成。TLR3識(shí)別病毒的雙鏈RNA,介導(dǎo)激活樹突狀細(xì)胞(DC)、巨噬細(xì)胞和B細(xì)胞,導(dǎo)致了I-IFN的產(chǎn)生。TLR3缺失小鼠則喪失了這種功能,容易遭受病毒的感染。TLR9識(shí)別病毒非甲基化的CpG序列,特別是發(fā)現(xiàn)單純皰疹病毒(HSV-2)感染骨髓細(xì)胞誘導(dǎo)了TLR9依賴性的IFN-a的產(chǎn)生,相似的結(jié)果也在HSV-1中發(fā)現(xiàn)。另一個(gè)確鑿的證據(jù)是T

4、LR9介導(dǎo)的抗鼠巨細(xì)胞病毒(MCMV)免疫。TLR9缺失小鼠則產(chǎn)生了較高的病毒滴度,并且死亡率大大增加。 TLR7與TLR8在序列上的高度同源性使得它們識(shí)別的配體相同,均為單鏈RNA病毒。最初鑒定的TLR7/TLR8配體為咪唑喹啉家族,該合成物具有很強(qiáng)的抗病毒活性,這也許是因?yàn)樗c核糖核酸在結(jié)構(gòu)上的相似性。隨后的研究證實(shí)了單鏈RNA為TLR7/TLR8的天然配體。基因缺失小鼠的研究表明,TLR7對于識(shí)別包括流感病毒(IV)和水泡

5、性口炎病毒(VSV)在內(nèi)的一些單鏈RNA病毒是必須的。對于IV或是HIV-1這些單鏈RNA病毒,即使在滅活的情況下也能激活pDCs,這似乎說明識(shí)別過程中并不要求活病毒的存在,不需要病毒復(fù)制過程,只要內(nèi)體里存在病毒基因組的核酸成分就可以激活。然而另外一些單鏈RNA病毒,如RSV、VSV,滅活后就不能激活pDCs,需要活病毒的感染,感染后復(fù)制過程中產(chǎn)生的中間產(chǎn)物RNA通過自體吞噬作用進(jìn)入內(nèi)體,才能激活pDCs。合成的一些單鏈RNA寡核苷酸(

6、ORN)可以模擬病毒RNA的作用,用脂質(zhì)體包裹轉(zhuǎn)染可以激活效應(yīng)細(xì)胞,誘導(dǎo)分泌細(xì)胞因子。RNA40(GCCCGUCUGUUGUGUGACUC)是第一條從單鏈RNA病毒(HIV-1)中篩選并確認(rèn)的RNA寡核苷酸,脂質(zhì)體包裹后可刺激激活PBMC、pDCs和NK細(xì)胞等。能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生了Th1型細(xì)胞因子,細(xì)胞因子的產(chǎn)生導(dǎo)致T和B細(xì)胞的旁激活,并且,ORN能夠促進(jìn)抗原特異性的CTL和IgG2a型抗體反應(yīng)。有些研究指出RNA寡核苷酸的免疫活性依賴于其堿

7、基組成和結(jié)構(gòu)特異性,目前,關(guān)于免疫刺激性RNA的序列特點(diǎn)沒有明確的說法,不過,似乎U堿基對于RNA的活性是必須的,所以另一部分研究認(rèn)為U的數(shù)量越多,免疫刺激活性越強(qiáng)。TLR7識(shí)別病毒的另一個(gè)研究方向在于,這種識(shí)別使得病毒在進(jìn)化過程中調(diào)整它們的基因組組成以逃避這種識(shí)別,一些滅活的單鏈RNA病毒就不能激活免疫反應(yīng),病毒逃避TLR7識(shí)別的另一個(gè)機(jī)制也許在其基因組中存在抑制性的序列。我們首先研究的是TLR7在丙肝病毒(HCV)感染中所起的作用。

8、機(jī)體被HCV感染后,55-85％的人發(fā)展成為慢性感染,大多數(shù)病人遭受了長期的肝臟炎癥,從而導(dǎo)致肝纖維化或肝硬化。雖然誘導(dǎo)肝細(xì)胞死亡的任何因素都會(huì)建立NF-kB相關(guān)的炎癥反應(yīng),但是確切的參與分子還不清楚。有研究顯示,TLR7單核苷酸多態(tài)性(SNP)與HCV感染后引起的炎癥反應(yīng)密切相關(guān),特殊位點(diǎn)的SNP對于肝纖維化的形成有顯著的影響。我們的研究發(fā)現(xiàn),與未感染者相比,HCV病染者外周血中促炎癥因子(TNF-a)水平明顯升高,并且檢測發(fā)現(xiàn),TL

9、R7在PBMC和pDC中的表達(dá)量顯著上調(diào)。鑒于HCV是一種單鏈RNA病毒,我們猜測很有可能TLR7介導(dǎo)了HCV的免疫反應(yīng)。在體外,我們用HCV的RNA與pDCs共孵育,發(fā)現(xiàn)pDCs被激活并在培養(yǎng)上清中檢測到IFN-a的分泌。為了說明HCV的核酸物質(zhì)通過TLR7的介導(dǎo)激活了pDCs,我們從HCV基因組中篩選了一些RNA寡核苷酸,用脂質(zhì)體包裹后刺激pDCs,發(fā)現(xiàn)在HCV核心區(qū)域上的一個(gè)RNA片段具有免疫活性,特別是HCV特有的Poly(U)

10、尾,具有很強(qiáng)的免疫刺激性,誘導(dǎo)了大量的IFN-a產(chǎn)生。TLR7的抑制物破壞了RNA的免疫活性,說明了TLR7參與HCV-RNA刺激pDCs的介導(dǎo)作用。肝癌細(xì)胞系Huh-7細(xì)胞上表達(dá)有TLR7,免疫刺激性的HCV-RNA與Huh-7作用誘導(dǎo)了轉(zhuǎn)錄因子NF-kB的核轉(zhuǎn)移,這些結(jié)果說明HCV-RNA在HCV持續(xù)感染期通過TLR7的介導(dǎo)作用,誘導(dǎo)了炎癥反應(yīng)。 適當(dāng)?shù)奶烊幻庖叻磻?yīng)對于抵抗病原體的感染是必須的,但是如果這種反應(yīng)過度,將會(huì)導(dǎo)致

11、長期的炎癥紊亂,造成病理性損傷。過度分泌的促炎癥因子(尤其是TNF-a)在慢性HCV感染中很常見,因此,TLR7在HCV感染中的激活是一把雙刃劍。那么,這種多余信號(hào)的清除就顯得非常重要了。機(jī)體有很多手段來實(shí)現(xiàn)這種抑制,例如在蛋白水平,TIR8/SIGIRR通過與TLR受體競爭結(jié)合干擾下游信號(hào)從而限制過度炎癥反應(yīng)：例如在基因轉(zhuǎn)錄水平,Bc1-3與p50形成的同型二聚體與TLR信號(hào)激活的基因結(jié)合可以阻止其轉(zhuǎn)錄。我們的研究發(fā)現(xiàn),HCV-RNA

12、與效應(yīng)細(xì)胞作用,誘導(dǎo)了miR-155的表達(dá)。MicroRNAs(miRNAs)是一種進(jìn)化上保守、大小約21-23個(gè)堿基的非編碼RNA,在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控細(xì)胞的形成與發(fā)育,因此異常的miRNA水平與惡性腫瘤的形成有關(guān)。以前的研究提示,miR-155在天然免疫、炎癥反應(yīng)和腫瘤間發(fā)揮非常重要的作用。對于免疫反應(yīng)的形成miR-155也是必不可少,并研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)miR-155的靶基因,miR-155在炎癥反應(yīng)中表達(dá)上調(diào)也已有報(bào)道,只是在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)

13、中的靶基因還沒有找到,我們的研究發(fā)現(xiàn),miR-155可以與TLR7通路中的TAB2分子結(jié)合,從而抑制了TAB2的表達(dá),進(jìn)而對整個(gè)炎癥反應(yīng)起負(fù)調(diào)控作用。為了說明TLR7識(shí)別單鏈RNA病毒在不同物種間和不同病毒間具有廣泛性,我們研究的第二個(gè)病毒是口蹄疫病毒(FMDV)。我們從FMDV基因組篩選得到了具有免疫活性的RNA序列,與PBMC作用誘導(dǎo)了IFN-a和IL-12p40的分泌。說明FMDV的核酸物質(zhì)也能與免疫系統(tǒng)的效應(yīng)細(xì)胞作用并激活這些細(xì)

14、胞。接著克隆了FMDV的宿主(豬)TLR7基因(pTLR7),將pTLR7轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞構(gòu)建細(xì)胞株,用FMDV-RNA刺激也能激活該細(xì)胞并誘導(dǎo)NF-kB的核轉(zhuǎn)移和細(xì)胞因子的產(chǎn)生。FMDV-RNA與PBMC作用也導(dǎo)致了獲得性免疫相關(guān)細(xì)胞的激活。這些結(jié)果說明,pTLR7也能夠介導(dǎo)FMDV這種單鏈RNA病毒的免疫激活。 綜上所述,本研究首次證明了在HCV感染中,TLR7介導(dǎo)HCV的單鏈RNA激活免疫系統(tǒng)的效應(yīng)細(xì)胞,誘導(dǎo)了炎癥因子

15、的表達(dá);并且在肝癌細(xì)胞上也表達(dá)有TLR7,HCV單鏈RNA也能通過其TLR7的介導(dǎo)誘導(dǎo)NF-kB的核轉(zhuǎn)移,活化生成炎癥反應(yīng)的信號(hào)通路:HCV-ssRNA的免疫刺激使得miR-155的表達(dá)上調(diào),實(shí)驗(yàn)證明了miR-155可以與TLR7通路中TAB2分子作用,抑制TAB2蛋白的表達(dá),從而負(fù)向調(diào)控了炎癥因子的分泌。TLR7對單鏈RNA病毒的識(shí)別在各物種間是普遍的,實(shí)驗(yàn)證明了FMDV的單鏈RNA能夠通過其宿主TLR7激活天然免疫反應(yīng)。在抗病毒的疫