TRIM31在抗病毒天然免疫中的功能及其機制研究.pdf

1、固有免疫是機體抵抗外界病毒、細菌等微生物感染的第一道防線，病毒的核酸成分可以引起機體的免疫應答反應。固有免疫的激活需要模式識別受體(patternrecognition receptors，PRRs)識別病原相關分子模式(Pathogen associated molecularpatterns，PAMPs)。細胞內(nèi)存在的多種模式識別受體可以識別病毒的核酸成分，如Toll樣受體(Toll-like receptors, TLRs)中的T

2、LR3、TLR7、TLR8和TLR9，可以識別暴露于細胞內(nèi)體中的病毒RNA和DNA。細胞漿中游離的RNA成分可被維甲酸誘導基因Ⅰ受體(RIG-Ⅰ-like receptors，RLRs)中的RIG-Ⅰ或MDA5所識別。游離于細胞漿中的病毒DNA成分則可以被cGAS、IFI16、DDX41等DNA受體識別。天然免疫細胞的PRRs識別病毒的核酸成分后，引起一系列信號通路的活化，誘導Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生，最終清除感染機體的病原微生物。
　　

3、線粒體抗病毒蛋白MAVS(也被稱作IPS1，VISA或Cardif)是RLRs信號通路中重要的接頭分子。研究表明，RNA病毒感染機體后可引起MAVS構象發(fā)生變化，形成朊蛋白樣(prion-like)聚集體。MAVS朊蛋白樣聚集體的形成對RLRs信號通路的活化起著關鍵作用，然而MAVS形成聚集體的分子機制并不清楚。MAVS在線粒體上的定位對其功能發(fā)揮起著決定性的作用，因此我們假設定位于線粒體上的蛋白可能會對MAVS的功能有一定的調控作用。

4、TRIM31屬于E3泛素連接酶家族中的一員，在癌癥等人類疾病中發(fā)揮著重要作用，也有文章報道TRIM31可以部分定位在線粒體上，因此本論文探索了TRIM31是否通過影響MAVS功能進而調控天然免疫抗病毒反應。我們的研究發(fā)現(xiàn)TRIM31可以正向調控MAVS所介導的Ⅰ型干擾素的生成，TRIM31特異性敲基因小鼠更加易于感染RNA病毒。具體機制依賴于TRIM31可以對MAVS第10位、第311位及第461位的賴氨酸進行K63位泛素化修飾，從而促

5、進MAVS朊蛋白樣聚集體的形成，最終促進Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生。
　　一.研究目的:
　　探討TRIM31是否影響MAVS所介導的信號通路，并闡明其具體分子機制，最后通過敲基因小鼠動物模型驗證TRIM31影響抗病毒天然免疫的生理意義。
　　二.研究方法:
　　1.TRIM31在細胞內(nèi)的定位
　　將含GFP標簽的TRIM31過表達載體轉染到HEK293T細胞中，培養(yǎng)24小時后，SeV感染6小時。免疫熒光技術檢測TR

6、IM31在線粒體上的定位情況。取健康C57 BL/6小鼠腹腔原代巨噬細胞，SeV感染不同時間點后，提取線粒體蛋白，Western Blotting方法檢測TRIM31在細胞漿及線粒體上的蛋白含量。
　　2.TRIM31調控IFN-β的產(chǎn)生和抗病毒反應
　　2.1.TRIM31過表達對IFN-β產(chǎn)生的影響
　　在HEK293T細胞系中轉染Flag標簽的TRIM31過表達載體，培養(yǎng)24小時后，SeV感染或轉染poly(I∶

7、C)系列時間點，實時熒光定量PCR方法檢測IFN-β產(chǎn)生的變化。
　　2.2.TRIM31干擾后對IFN-β產(chǎn)生的影響
　　提取小鼠腹腔原代巨噬細胞，轉染小干擾RNA減低TRIM31的表達，SeV感染不同時間點，實時熒光定量PCR和ELISA技術檢測IFN-β產(chǎn)生及分泌。
　　2.3.TRIM31對病毒復制的影響
　　分別轉染TRIM31干擾RNA或者TRIM31過表達載體于HEK293T細胞中，用VSV感染不同

8、時間點，實時熒光定量PCR方法檢測IFN-β產(chǎn)生和VSV mRNA水平的變化;利用熒光顯微鏡直接觀察病毒的復制情況;收集細胞上清，利用病毒空斑實驗檢測病毒滴度情況。
　　3.TRIM31敲除對機體抗病毒的生理意義
　　3.1.TRIM31敲除后對IFN-β產(chǎn)生的影響
　　提取野生型小鼠和TRIM31敲基因小鼠的腹腔原代巨噬細胞，分別用5'ppp-RNA、LPS、Poly(I∶C)等刺激，或者SeV、HSV-1感染，實時

9、熒光定量PCR方法檢測IFN-β及IFN相關基因的表達。
　　3.2.TRIM31敲除對機體中病毒復制的影響
　　取野生型小鼠和TRIM31敲基因小鼠的腹腔原代巨噬細胞，用VSV或HSV-1感染不同時間點，實時熒光定量PCR方法檢測IFN-β表達和病毒mRNA水平的變化;收集細胞上清，病毒空斑實驗方法檢測病毒滴度;Western Blotting方法檢測VSV蛋白的表達變化。
　　取野生型小鼠和TRIM31敲基因小鼠，

10、腹腔注射VSV或HSV-1，24小時后小鼠眼球取血的到血清，ELISA檢測血清中IFN-β分泌變化;取肝臟、脾臟、肺臟及腦組織，提取總RNA，實時熒光定量PCR方法檢測組織中IFN-β和病毒mRNA水平的變化;提取蛋白，Western Blotting方法檢測VSV蛋白水平的變化;組織研磨得到上清，病毒空斑實驗方法檢測病毒滴度變化;免疫組化及HE染色方法觀察組織損傷情況。
　　4.TRIM31對RLR信號通路活化的影響
　　

11、將TRIM31過表達質粒轉染HEK293T細胞系24小時后，SeV或HSV-1感染不同時間點，Western Blotting檢測TBK-1、IRF3磷酸化情況及IRF3在胞質、胞核中的含量變化情況;非變性Western Blotting檢測IRF3二聚化情況;通過雙熒光素酶報告基因手段檢測IRF3報告基因活性的變化情況。
　　取野生型小鼠和TRIM31敲基因小鼠的腹腔原代巨噬細胞，SeV或HSV-1感染不同時間點，Western

12、 Blotting檢測TBK-1、IRF3磷酸化情況及IRF3在胞質、胞核中的變化情況;非變性Western Blotting檢測IRF3二聚化情況。
　　5.TRIM31靶分子的尋找
　　將RLR信號通路中相關的接頭分子RIG-Ⅰ、MDA5、MAVS、TBK1、IKKε、IRF3-5D等過表達載體與TRIM31表達載體共轉染HEK293T細胞系，利用實時熒光定量PCR及雙熒光素酶報告基因技術檢測TRIM31對不同接頭蛋白所

13、介導的IFN-β mRNA表達及報告基因活性的影響。將相關接頭分子過表達載體與TRIM31表達載體共轉染HEK293T細胞，免疫共沉淀實驗檢測TRIM31與各接頭分子的結合情況。
　　6.TRIM31與MAVS結合實驗
　　提取C56BL/6小鼠腹腔原代巨噬細胞，SeV感染不同時間點，用TRIM31特異性抗體進行免疫共沉淀實驗，檢測內(nèi)源性TRIM31與MAVS的結合。
　　利用體外翻譯系統(tǒng)分別得到TRIM31與MAVS

14、的蛋白，免疫共沉淀實驗檢測體外表達的TRIM31與MAVS的結合情況。
　　分別構建TRIM31的截斷突變體與MAVS的截斷突變體，共轉染HEK293T細胞系，免疫共沉淀實驗檢測TRIM31與MAVS的截斷突變體的結合情況，尋找TRIM31與MAVS發(fā)生結合的關鍵結構域。
　　7.TRIM31對MAVS的泛素化情況
　　將Flag標簽的TRIM31過表達載體、Myc標簽的目的分子過表達載體和HA標簽的泛素過表達載體（W

15、T、K48或K63）共轉染HEK293T細胞系，24小時后提取蛋白，用Myc特異性抗體進行免疫共沉淀，Western Blotting檢測TRIM31對目的分子泛素化水平的影響及泛素化形式的影響。
　　構建一系列Myc標簽的MAVS賴氨酸點突變過表達載體，分別與Flag標簽的TRIM31過表達載體和HA標簽的泛素過表達載體共轉染HEK293T細胞系，24小時后提取蛋白，免疫共沉淀技術檢測TRIM31對不同賴氨酸點突變載體泛素化的影

16、響，探討MAVS上被TRIM31催化形成泛素鏈的賴氨酸位點。
　　提取野生型小鼠和TRIM31敲基因小鼠的腹腔原代巨噬細胞，SeV感染不同時間點后，提取細胞蛋白，利用MAVS特異性抗體進行免疫共沉淀，Western Blotting方法檢測TRIM31對MAVS內(nèi)源性泛素化水平的影響。
　　將MAVS構建到含有T7啟動子的PCDNA3.1-Myc過表達載體上，將TRIM31構建到含有T7啟動子的PCDNA3.1-Flag過表

17、達載體上，使用Promega公司的體外轉錄翻譯系統(tǒng)(TNT Quick Coupled Transcription/Translation System)對表達載體進行體外轉錄翻譯，將翻譯的蛋白，加入Boston Biochem公司生產(chǎn)的體外泛素修飾系統(tǒng)（包含E1，UbcH5a，K48, K63，K48R或者K63R等蛋白），室溫反應，使用Myc標簽抗體進行免疫共沉淀，檢測TRIM31對MAVS進行in vitro泛素化的情況及泛素化形

18、式。
　　8.TRIM31通過E3連接酶活性影響RLR信號通路
　　構建TRIM31泛素連接酶功能缺失點突變載體，利用實時熒光定量PCR技術，雙熒光素酶報告基因技術，Western Blotting技術檢測TRIM31泛素連接酶功能缺失后對RLR信號通路介導的IFN-β產(chǎn)生的影響，對病毒復制的影響，對MAVS泛素化的影響，以及對MAVS多聚化形成的影響。
　　9.基因恢復實驗進一步證實證明TRIM31通過泛素化MAVS

19、影響RLR介導的信號通路
　　提取TRIM31缺陷MEF細胞，分別轉染空對照載體、野生型TRIM31過表達載體及E3泛素連接酶功能缺失點突變過表達載體，用實時熒光定量PCR技術，雙熒光素酶報告基因技術，Western Blotting技術檢測特異性恢復TRIM31基因表達后對IFN-β產(chǎn)生的影響，對病毒復制的影響，對MAVS泛素化的影響，以及對MAVS多聚化形成的影響。
　　10.TRIM31對MAVS形成朊蛋白樣多聚體的影

20、響
　　轉染TRIM31過表達載體于HEK293T細胞系，或者用TRIM31敲基因小鼠的腹腔原代巨噬細胞、小鼠胚胎成纖維細胞，SeV感染不同時間點后，提取細胞線粒體，直接利用SDD-AGE方法檢測TRIM31過表達或者缺失后對MAVS朊蛋白樣多聚體形成的影響;或者將提取的SeV預刺激的線粒體進行體外泛素化修飾，反應結束后，再SDD-AGE方法檢測TRIM31對MAVS體外朊蛋白樣多聚體形成的影響。
　　三.實驗結果
　

21、　1.RNA病毒感染介導TRIM31募集到線粒體上
　　有文獻報道，TRIM31分布于線粒體上及細胞漿中，為了進一步研究RNA病毒感染是否影響TRIM31在線粒體的定位，我們將含有GFP標簽的TRIM31過表達載體轉染到HEK293T細胞中，培養(yǎng)24小時后，再感染SeV6小時，利用線粒體標記蛋白作為參照，免疫熒光技術觀察TRIM31在線粒體上的定位情況。我們發(fā)現(xiàn)SeV病毒感染介導了TRIM31向線粒體上募集。
　　提取C57

22、BL/6小鼠腹腔原代巨噬細胞，SeV感染不同時間點后，提取線粒體蛋白，用Western Blotting方法檢測TRIM31在線粒體上的含量，我們發(fā)現(xiàn)細胞SeV病毒感染后，定位于線粒體上TRIM31蛋白含量明顯增加。以上結果提示我們RNA病毒感染會引起TRIM31向線粒體的募集。
　　2.TRIM31正向調控RLR介導的IFN-β的產(chǎn)生進而增強天然免疫抗病毒反應
　　2.1.TRIM31過表達促進RNA病毒介導的IFN-β的

23、產(chǎn)生
　　為了探究TRIM31是否影響RLR信號通路，在HEK293T細胞或Hela細胞中轉染Flag標簽的TRIM31過表達載體，培養(yǎng)24小時后，SeV分別感染4小時、8小時、12小時或轉染poly(I∶C)6小時、12小時，實時熒光定量PCR的方法檢測IFN-β mRNA水平的變化，我們發(fā)現(xiàn)TRIM31過表達后，SeV感染及poly(I∶C)轉染引起的IFN-β mRNA水平明顯升高。這預示著TRIM31正向調控RLR所介導的

24、IFN-β的產(chǎn)生。
　　2.2.TRIM31干擾抑制RNA病毒介導的IFN-β的產(chǎn)生。
　　為了進一步明確TRIM31在RLR信號通路所起的作用，我們合成了TRIM31小鼠源和人源的小干擾RNA，提取小鼠腹腔原代巨噬細胞，用轉染小干擾的方法將降低TRIM31的表達，SeV分別感染4小時、8小時、12小時，實時熒光定量PCR技術和ELISA技術檢測IFN-β產(chǎn)生及分泌。結果顯示，TRIM31干擾后，SeV感染所介導的IFN-β

25、的在mRNA水平及分泌水平都出現(xiàn)明顯下降，這進一步證明了TRIM31可以正向調控RLR所介導的IFN-β的產(chǎn)生。
　　2.3.TRIM31的抗病毒作用
　　為了研究TRIM31對機體的抗病毒作用，轉染TRIM31特異性小干擾RNA或者TRIM31過表達載體于HEK293T細胞系，培養(yǎng)24小時候，用含有綠色熒光蛋白的VSV-GFP進行感染，實時熒光定量PCR技術檢測IFN-β的產(chǎn)生和VSVmRNA水平的變化;利用熒光顯微鏡直接

26、觀察病毒的復制情況;收集細胞上清，進行病毒空斑實驗檢測病毒滴度。我們發(fā)現(xiàn)TRIM31干擾后，VSV感染引起IFN-βmRNA水平表達明顯下降，進而使得VSV病毒逃逸并大量復制。病毒空斑實驗同樣發(fā)現(xiàn)TRIM31干擾組中VSV病毒滴度明顯升高。相反的，過表達TRIM31之后，VSV介導的IFN-β mRNA水平的產(chǎn)生明顯升高，VSV病毒mRNA水平明顯下降，熒光顯微鏡觀察病毒的復制能力減弱，病毒空斑實驗證明TRIM31過表達組的VSV病毒滴

27、度明顯下降。由此我們可以看到TRIM31在機體抗病毒中起著十分重要的作用。
　　3.TRIM31抗病毒的生理意義
　　3.1.TRIM31缺陷抑制RNA病毒引起的IFN-β產(chǎn)生
　　為了進一步驗證TRIM31在RLR信號通路中所起的作用及TRIM31抗病毒的生理意義，我們構建了TRIM31特異性敲基因小鼠，提取野生型小鼠和TRIM31敲基因小鼠的腹腔原代巨噬細胞，分別使用LPS、Poly(I∶C)等TLR通路配體刺激細

28、胞，SeV、VSV等RLR通路配體感染細胞，HSV-1等DNA配體感染細胞，實時熒光定量PCR方法檢測IFN-β及IFN相關基因ISGs的表達差異，我們發(fā)現(xiàn)SeV感染或5'ppp-RNA轉染后，TRIM31敲基因小鼠腹腔原代巨噬細胞所表達的IFN-β以及IFN-β相關基因如Ccl5、Cxcl10的表達明顯下降。而使用LPS、Poly(I∶C)刺激或HSV-1感染的野生型小鼠和TRIM31敲基因小鼠的腹腔原代巨噬細胞所表達的IFN-β以及

29、IFN-β相關基因無明顯變化差異。我們分別提取野生型小鼠和TRIM31敲基因小鼠的胚胎成纖維細胞或者骨髓來源巨噬細胞，重復上面的實驗，得到相似的結論。這說明TRIM31特異性敲除可以明顯抑制RNA病毒介導的Ⅰ型干擾素的生成，而對TLR信號通路等沒有影響。
　　3.2.TRIM31敲基因小鼠更易于感染RNA病毒
　　由于Ⅰ型干擾素與病毒的復制、清除有著直接關系，我們進一步研究了TRIM31在機體抵抗病毒復制方面的生理意義，提取

30、野生型小鼠和TRIM31敲基因小鼠的腹腔原代巨噬細胞，然后用VSV或HSV-1進行感染，實時熒光定量PCR技術檢測IFN-β和VSV在mRNA水平的變化;收集細胞上清，利用病毒空斑實驗檢測病毒滴度差異。收取細胞蛋白，Western Blotting方法檢測VSV蛋白水平的表達差異。我們發(fā)現(xiàn)與野生小鼠相比較，TRIM31敲基因小鼠被VSV感染后產(chǎn)生IFN-β在mRNA水平明顯下降，而VSV在mRNA水平則明顯升高;病毒空斑實驗顯示TRIM

31、31敲基因小鼠VSV病毒滴度明顯升高。
　　我們通過腹腔注射VSV病毒的方法建立小鼠的RNA病毒感染模型，觀察小鼠的死亡率，繪制小鼠生存曲線，發(fā)現(xiàn)TRIM31敲基因小鼠在病毒感染后的死亡率更高;小鼠眼球取血得到血清，ELISA方法檢測TRIM31敲基因小鼠感染后血清中IFN-β的產(chǎn)量明顯低于野生型小鼠;處死小鼠后取肝臟、脾臟和肺臟，提取組織總RNA和蛋白，實時熒光定量PCR方法檢測到TRIM31敲基因小鼠感染后的肝臟、脾臟和肺臟中

32、IFN-β的表達明顯低于野生型小鼠，而VSV的mRNA則明顯高于野生型小鼠;Western Blotting方法檢測同樣發(fā)現(xiàn)TRIM31敲基因小鼠感染后各組織中VSV蛋白含量也是明顯高于野生型小鼠;肝臟、脾臟和肺臟等組織研磨得到上清，病毒空斑實驗檢測病毒滴度，發(fā)現(xiàn)TRIM31敲基因小鼠感染后的病毒滴度明顯高于野生型小鼠;取小鼠肺臟組織進行免疫組織化學及HE染色，觀察肺損傷情況，發(fā)現(xiàn)TRIM31敲基因小鼠病毒感染后肺損傷比野生型小鼠更加嚴

33、重。以上結果說明相比于野生型小鼠，TRIM31敲基因小鼠更容易感染RNA病毒。我們通過腹腔注射HSV-1病毒的方法建立小鼠的DNA病毒感染模型重復以上實驗，則發(fā)現(xiàn)，野生型小鼠和TRIM31敲基因小鼠在抵抗DNA病毒的過程中沒有明顯的差異。
　　4.TRIM31對RLR信號通路活化的影響
　　RLR信號通路活化后可以引起TBK1的自身磷酸化及激酶活性的激活，進而引起IRF3的磷酸化，磷酸化后的IRF3發(fā)生二聚化并入核，結合到I

34、FN的啟動子區(qū)域，引起IFN-β的產(chǎn)生。因此，TBK1的磷酸化及IRF3的磷酸化、二聚化、入核代表RLR信號通路的活化。我們轉染TRIM31過表達載體于HEK293T細胞系，分別用SeV感染4小時、8小時、12小時，Western Blotting檢測發(fā)現(xiàn)TRIM31過表達后病毒介導的TBK-1和IRF3磷酸化明顯增強，IRF3進入細胞核中的含量也明顯增加，利用非變性Western Blotting發(fā)現(xiàn)過表達TRIM31可以促進病毒介導

35、的IRF3二聚體的形成。利用雙熒光素酶報告基因技術檢測IRF3活性的變化，將IRF3的報告基因與TRIM31過表達質粒共轉染HEK293T，SeV感染后，我們發(fā)現(xiàn)過表達TRIM31明顯促進病毒介導的IRF3的報告基因的活性。利用DNA病毒HSV-1感染細胞，利用以上手段發(fā)現(xiàn)TRIM31過表達并未影響DNA病毒介導的TBK1、IRF3的磷酸化。
　　提取野生型小鼠和TRIM31敲基因小鼠腹腔原代巨噬細胞，分別用SeV感染細胞，Wes

36、tern Blotting檢測手段發(fā)現(xiàn)TRIM31敲除后SeV介導的TBK-1和IRF3磷酸化明顯減弱，IRF3進入細胞核中的含量也明顯減少，利用非變性WesternBlotting發(fā)現(xiàn)TRIM31敲除可以抑制IRF3二聚體的形成。利用DNA病毒HSV-1感染細胞，重復上述實驗，發(fā)現(xiàn)HSV-1介導的TBK1及IRF3的活化并未受到影響。以上結果從多個層次說明TRIM31特異性促進RLR信號通路的活化，而對DNA病毒介導的信號通路活化沒有

37、影響。
　　5.TRIM31靶分子的尋找
　　前面結果表明TRIM31促進RNA病毒引起的IFN-β的產(chǎn)生，對病毒的復制起著明顯的抑制作用。那么TRIM31是如何影響RLR所介導的信號通路的，具體的作用靶點是什么。接下來，我們將RLR信號通路中相關的接頭分子RIG-Ⅰ、MDA5、MAVS、TBK1、IKKε、IRF3-5D等接頭蛋白的過表達載體與TRIM31表達載體共轉染HEK293T細胞系，利用實時熒光定量PCR及雙熒光素

38、酶報告基因技術檢測TRIM31對不同接頭蛋白所介導的IFN-β mRNA產(chǎn)生及報告基因活性的影響，我們發(fā)現(xiàn)TRIM31過表達明顯可以促進RIG-Ⅰ、MDA5、MAVS接頭蛋白所介導的IFN-β mRNA的產(chǎn)生以及IFN-β報告基因活性，而對接頭TBK1、IKKε、IRF3-5D介導的IFN-β的產(chǎn)生沒有影響。結合之前我們發(fā)現(xiàn)TRIM31在RNA病毒感染后可以募集到線粒體上的現(xiàn)象，提示我們TRIM31作用靶點有可能是MAVS。為了進一步驗

39、證這一假設，我們將RIG-Ⅰ、MDA5、MAVS、TBK1、IKKε、IRF3-5D等接頭蛋白的過表達載體與TRIM31過表達載體共轉染HEK293T細胞系，免疫共沉淀實驗檢測TRIM31與各接頭分子的結合情況，結果顯示TRIM31與MAVS有明顯結合作用，而與其他接頭分子沒有結合作用。因此我們得出結論TRIM31可能通過靶向MAVS進而調控RLR所介導的信號通路。
　　6.TRIM31的coiled-coil結構域與MAVS的p

40、roline-rich結構域相結合
　　為了更加細致深入的研究TRIM31與MAVS的結合情況，我們進一步檢測了它們內(nèi)源性的結合情況，提取小鼠腹腔原代巨噬細胞，SeV感染不同時間點，用內(nèi)源性TRIM31抗體進行免疫共沉淀實驗，檢測內(nèi)源性TRIM31與MAVS的結合，我們觀察到隨著病毒感染時間的增加，TRIM31與MAVS結合也逐漸增強，兩者的結合存在時間依賴性。為了進一步驗證兩者是否是直接性結合，我們利用體外翻譯系統(tǒng)，過表達TRI

41、M31與MAVS的蛋白，免疫共沉淀實驗檢測發(fā)現(xiàn)外源性表達TRIM31與MAVS發(fā)生了直接結合。為了探究TRIM31與MAVS發(fā)生結合的具體結構域，我們構建了一系列TRIM31與MAVS的截斷突變體，將各截斷體共轉染HEK293T細胞系，免疫共沉淀實驗檢測TRIM31與MAVS的截斷突變體的結合情況，實驗表明TRIM31的coiled-coil結構域與MAVS的proline-rich結構域在TRIM31與MAVS的結合過程中起著重要的作

42、用。
　　7.TRIM31對MAVS的泛素化實驗
　　TRIM31屬于TRIM家族，是E3泛素連接酶的一種，因此我們想進一步明確TRIM31對MAVS是否進行了泛素化修飾。我們將Flag標簽的TRIM31過表達載體，Myc標簽MAVS過表達載體和HA標簽的泛素表達載體共轉染HEK293T細胞系，培養(yǎng)24小時后提取蛋白，用Myc特異性抗體進行免疫共沉淀，WesternBlotting結果顯示TRIM31可以促進MAVS的K63

43、位泛素化修飾。MAVS分子上共有14個賴氨酸位點，為了詳細闡明TRIM31對其中哪個氨基酸位點進行了泛素化修飾，我們構建了一系列MAVS賴氨酸點突變過表達載體，與TRIM31過表達載體及泛素過表達載體共轉染HEK293T細胞系，免疫共沉淀技術及Western Blotting技術檢測發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)TRIM31主要將MAVS上的第10位，第311位，第461位賴氨酸進行K63位泛素化修飾。提取野生型小鼠和TRIM31敲基因小鼠的腹腔原代巨噬細胞

44、，SeV感染不同時間點，提取細胞蛋白，利用MAVS內(nèi)源性抗體進行免疫共沉淀，Western Blotting技術檢測發(fā)現(xiàn)TRIM31敲除后SeV介導的MAVS內(nèi)源性K63位泛素化水平明顯下降，而TRIM31對MAVS的K48位泛素化修飾無明顯影響。我們進一步通過體外蛋白翻譯系統(tǒng)和體外泛素化系統(tǒng)，檢測TRIM31對MVAS的體外泛素化修飾情況，結果表明TRIM31可以在體外系統(tǒng)直接促進MAVS的K63位泛素化修飾。以上結果表明，E3泛素連

45、接酶TRIM31可以將MAVS的第10位，第311位，第461位賴氨酸進行K63位泛素化修飾。
　　8.TRIM31通過其E3泛素連接酶功能對RLR信號通路的影響
　　為了進一步驗證TRIM31是否通過其E3泛素連接酶功能影響RLR信號通路，我們構建了TRIM31泛素連接酶功能缺失點突變過表達載體，通過實時熒光定量PCR技術、雙熒光素酶報告基因技術、Western Blotting技術檢測發(fā)現(xiàn)缺失了E3泛素連接酶功能后，TR

46、IM31對RLR信號通路介導的IFN-β的產(chǎn)生失去了促進作用，TRIM31的抗病毒作用也隨即消失。以上結論說明TRIM31通過其E3泛素連接酶活性促進RLR介導的Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生及抗病毒作用。
　　9.TRIM31促進MAVS的多聚化
　　TRIM31對MAVS進行K63位泛素化修飾的機制我們已做了大量研究，然而TRIM31對MAVS修飾后如何調控MAVS的功能是我們進一步要探討的重要問題。已有文章報道MAVS在RNA病毒感

47、染后形成朊蛋白樣多聚體，該多聚體的形成對于MAVS進一步活化下游信號通路起到至關重要的作用，然而MAVS如何形成朊蛋白樣多聚體還不得而知。因此我們進行實驗驗證TRIM31對MAVS的K63泛素化修飾是否促進MAVS多聚體的形成。我們分別轉染空載體及TRIM31過表達載體于HEK293T細胞系，SeV感染不同時間點后，提取細胞線粒體，利用SDD-AGE技術檢測發(fā)現(xiàn)TRIM31過表達明顯促進SeV介導的MAVS多聚體的形成。我們進一步提取S

48、eV預刺激后巨噬細胞的線粒體，與體外翻譯得到的TRIM31蛋白共同加入體外泛素化系統(tǒng)，反應結束后，SDD-AGE檢測發(fā)現(xiàn)TRIM31體外明顯促進SeV介導的MAVS多聚體的形成。提取野生型小鼠和TRIM31敲基因小鼠的腹腔原代巨噬細胞，SeV感染不同時間點，提取線粒體蛋白，SDD-AGE技術檢測發(fā)現(xiàn)TRIM31敲除后明顯抑制SeV介導的MAVS多聚體的形成。以上實驗表明TRIM31可以促進MAVS朊蛋白樣多聚化的形成，進而影響MAVS的

49、活化及IFN-β的產(chǎn)生。
　　10.基因恢復實驗證明TRIM31特異性調控MAVS活化及RLR介導的信號通路
　　我們提取TRIM31敲基因小鼠MEF細胞，分別轉染空載體及TRIM31過表達載體，SeV或VSV感染細胞，分別使用實時熒光定量PCR技術，雙熒光素酶報告基因技術，ELISA技術，Western Blotting技術進行檢測，我們發(fā)現(xiàn)TRIM31基因敲除后SeV誘導的MAVS形成朊蛋白樣多聚體的能力減弱，IFN-β

50、產(chǎn)生減少，病毒復制明顯增加;重新過表達TRIM31后，由TRIM31缺陷導致的對RLR信號通路及病毒復制的影響隨即消失。以上結果進一步證明了TRIM31對于RLR介導信號通路的影響。
　　我們同樣利用基因恢復實驗進一步驗證了MAVS的K63位泛素化對RLR信號轉導過程的影響，在MAVS特異性敲除MEF細胞中，重新轉染野生型MAVS過表達載體、K10、K311、K461位賴氨酸位點突變MAVS過表達載體與野生型TRIM31過表達載體

51、、E3連接酶功能缺失點突變過表達載體載體，SeV或VSV感染一系列時間點，利用實時熒光定量PCR，雙熒光素酶報告基因技術，WesternBlotting技術檢測發(fā)現(xiàn)，MAVS敲除后，SeV介導的RLR信號通路被阻斷，重新轉染野生型MAVS后，RLR介導的Ⅰ型干擾素產(chǎn)生得到恢復;TRIM31過表達促進RLR介導的Ⅰ型干擾素的生成;然而轉染K10、K311、K461位賴氨酸位點突變MAVS表達載體后，RLR介導的信號通路的阻斷不能得到恢復。

52、以上結果說明TRIM31對于MAVS的K10、K311、K461位賴氨酸位點的K63位泛素化直接影響MAVS活化及RLR信號通路的轉導。
　　四.結論及創(chuàng)新性
　　1.首次證明了TRIM31在RLR信號通路中發(fā)揮作用
　　TRIM31屬于TRIM家族中的一員，已有研究表明TRIM31在消化系統(tǒng)相關癌癥中發(fā)揮著重要作用。然而TRIM31是否參與到天然免疫信號轉導目前還沒有報道。我們首先發(fā)現(xiàn)了TRIM31在RNA病毒介導的

53、天然免疫信號轉導及機體抗病毒反應中發(fā)揮著重要的調控作用。
　　2.首次發(fā)現(xiàn)了對MAVS進行K63位泛素化修飾的分子
　　對于MAVS的泛素化修飾大多集中在K48位泛素化修飾，至今仍未發(fā)現(xiàn)對MAVS發(fā)生K63位泛素化修飾的分子，我們的發(fā)現(xiàn)填補了這一空白。我們發(fā)現(xiàn)TRIM31促進IFN-β的產(chǎn)生，這一現(xiàn)象是通過其E3泛素連接酶對MAVS進行K63位泛素化修飾引起的;同時我們明確了對TRIM31對MAVS泛素化修飾的位點，分別是M

54、AVS第10位，第311位，第461位賴氨酸。
　　3.為探索影響MAVS多聚化形成的因素提供了新思路
　　MAVS作為RLR信號通路重要的接頭蛋白，RNA病毒感染機體后，MAVS構象發(fā)生改變，形成朊蛋白樣多聚體，該多聚體的形成是MAVS活化下游信號通路的前提條件，然而對于MAVS多聚化形成的調節(jié)機制并不明確。我們研究發(fā)現(xiàn)，SeV感染后，TRIM31募集到線粒體上，并與MAVS結合并促進MAVS發(fā)生K63位泛素化修飾，這種K