TRIM31在抗病毒天然免疫中的功能及其機制研究.pdf

1、固有免疫是機體抵抗外界病毒、細(xì)菌等微生物感染的第一道防線，病毒的核酸成分可以引起機體的免疫應(yīng)答反應(yīng)。固有免疫的激活需要模式識別受體(patternrecognition receptors，PRRs)識別病原相關(guān)分子模式(Pathogen associated molecularpatterns，PAMPs)。細(xì)胞內(nèi)存在的多種模式識別受體可以識別病毒的核酸成分，如Toll樣受體(Toll-like receptors, TLRs)中的T

2、LR3、TLR7、TLR8和TLR9，可以識別暴露于細(xì)胞內(nèi)體中的病毒RNA和DNA。細(xì)胞漿中游離的RNA成分可被維甲酸誘導(dǎo)基因Ⅰ受體(RIG-Ⅰ-like receptors，RLRs)中的RIG-Ⅰ或MDA5所識別。游離于細(xì)胞漿中的病毒DNA成分則可以被cGAS、IFI16、DDX41等DNA受體識別。天然免疫細(xì)胞的PRRs識別病毒的核酸成分后，引起一系列信號通路的活化，誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生，最終清除感染機體的病原微生物。
　　

3、線粒體抗病毒蛋白MAVS(也被稱作IPS1，VISA或Cardif)是RLRs信號通路中重要的接頭分子。研究表明，RNA病毒感染機體后可引起MAVS構(gòu)象發(fā)生變化，形成朊蛋白樣(prion-like)聚集體。MAVS朊蛋白樣聚集體的形成對RLRs信號通路的活化起著關(guān)鍵作用，然而MAVS形成聚集體的分子機制并不清楚。MAVS在線粒體上的定位對其功能發(fā)揮起著決定性的作用，因此我們假設(shè)定位于線粒體上的蛋白可能會對MAVS的功能有一定的調(diào)控作用。

4、TRIM31屬于E3泛素連接酶家族中的一員，在癌癥等人類疾病中發(fā)揮著重要作用，也有文章報道TRIM31可以部分定位在線粒體上，因此本論文探索了TRIM31是否通過影響MAVS功能進(jìn)而調(diào)控天然免疫抗病毒反應(yīng)。我們的研究發(fā)現(xiàn)TRIM31可以正向調(diào)控MAVS所介導(dǎo)的Ⅰ型干擾素的生成，TRIM31特異性敲基因小鼠更加易于感染RNA病毒。具體機制依賴于TRIM31可以對MAVS第10位、第311位及第461位的賴氨酸進(jìn)行K63位泛素化修飾，從而促

5、進(jìn)MAVS朊蛋白樣聚集體的形成，最終促進(jìn)Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生。
　　一.研究目的:
　　探討TRIM31是否影響MAVS所介導(dǎo)的信號通路，并闡明其具體分子機制，最后通過敲基因小鼠動物模型驗證TRIM31影響抗病毒天然免疫的生理意義。
　　二.研究方法:
　　1.TRIM31在細(xì)胞內(nèi)的定位
　　將含GFP標(biāo)簽的TRIM31過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞中，培養(yǎng)24小時后，SeV感染6小時。免疫熒光技術(shù)檢測TR

6、IM31在線粒體上的定位情況。取健康C57 BL/6小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞，SeV感染不同時間點后，提取線粒體蛋白，Western Blotting方法檢測TRIM31在細(xì)胞漿及線粒體上的蛋白含量。
　　2.TRIM31調(diào)控IFN-β的產(chǎn)生和抗病毒反應(yīng)
　　2.1.TRIM31過表達(dá)對IFN-β產(chǎn)生的影響
　　在HEK293T細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染Flag標(biāo)簽的TRIM31過表達(dá)載體，培養(yǎng)24小時后，SeV感染或轉(zhuǎn)染poly(I∶

7、C)系列時間點，實時熒光定量PCR方法檢測IFN-β產(chǎn)生的變化。
　　2.2.TRIM31干擾后對IFN-β產(chǎn)生的影響
　　提取小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞，轉(zhuǎn)染小干擾RNA減低TRIM31的表達(dá)，SeV感染不同時間點，實時熒光定量PCR和ELISA技術(shù)檢測IFN-β產(chǎn)生及分泌。
　　2.3.TRIM31對病毒復(fù)制的影響
　　分別轉(zhuǎn)染TRIM31干擾RNA或者TRIM31過表達(dá)載體于HEK293T細(xì)胞中，用VSV感染不同

8、時間點，實時熒光定量PCR方法檢測IFN-β產(chǎn)生和VSV mRNA水平的變化;利用熒光顯微鏡直接觀察病毒的復(fù)制情況;收集細(xì)胞上清，利用病毒空斑實驗檢測病毒滴度情況。
　　3.TRIM31敲除對機體抗病毒的生理意義
　　3.1.TRIM31敲除后對IFN-β產(chǎn)生的影響
　　提取野生型小鼠和TRIM31敲基因小鼠的腹腔原代巨噬細(xì)胞，分別用5'ppp-RNA、LPS、Poly(I∶C)等刺激，或者SeV、HSV-1感染，實時

9、熒光定量PCR方法檢測IFN-β及IFN相關(guān)基因的表達(dá)。
　　3.2.TRIM31敲除對機體中病毒復(fù)制的影響
　　取野生型小鼠和TRIM31敲基因小鼠的腹腔原代巨噬細(xì)胞，用VSV或HSV-1感染不同時間點，實時熒光定量PCR方法檢測IFN-β表達(dá)和病毒mRNA水平的變化;收集細(xì)胞上清，病毒空斑實驗方法檢測病毒滴度;Western Blotting方法檢測VSV蛋白的表達(dá)變化。
　　取野生型小鼠和TRIM31敲基因小鼠，

10、腹腔注射VSV或HSV-1，24小時后小鼠眼球取血的到血清，ELISA檢測血清中IFN-β分泌變化;取肝臟、脾臟、肺臟及腦組織，提取總RNA，實時熒光定量PCR方法檢測組織中IFN-β和病毒mRNA水平的變化;提取蛋白，Western Blotting方法檢測VSV蛋白水平的變化;組織研磨得到上清，病毒空斑實驗方法檢測病毒滴度變化;免疫組化及HE染色方法觀察組織損傷情況。
　　4.TRIM31對RLR信號通路活化的影響
　　

11、將TRIM31過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞系24小時后，SeV或HSV-1感染不同時間點，Western Blotting檢測TBK-1、IRF3磷酸化情況及IRF3在胞質(zhì)、胞核中的含量變化情況;非變性Western Blotting檢測IRF3二聚化情況;通過雙熒光素酶報告基因手段檢測IRF3報告基因活性的變化情況。
　　取野生型小鼠和TRIM31敲基因小鼠的腹腔原代巨噬細(xì)胞，SeV或HSV-1感染不同時間點，Western

12、 Blotting檢測TBK-1、IRF3磷酸化情況及IRF3在胞質(zhì)、胞核中的變化情況;非變性Western Blotting檢測IRF3二聚化情況。
　　5.TRIM31靶分子的尋找
　　將RLR信號通路中相關(guān)的接頭分子RIG-Ⅰ、MDA5、MAVS、TBK1、IKKε、IRF3-5D等過表達(dá)載體與TRIM31表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞系，利用實時熒光定量PCR及雙熒光素酶報告基因技術(shù)檢測TRIM31對不同接頭蛋白所

13、介導(dǎo)的IFN-β mRNA表達(dá)及報告基因活性的影響。將相關(guān)接頭分子過表達(dá)載體與TRIM31表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，免疫共沉淀實驗檢測TRIM31與各接頭分子的結(jié)合情況。
　　6.TRIM31與MAVS結(jié)合實驗
　　提取C56BL/6小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞，SeV感染不同時間點，用TRIM31特異性抗體進(jìn)行免疫共沉淀實驗，檢測內(nèi)源性TRIM31與MAVS的結(jié)合。
　　利用體外翻譯系統(tǒng)分別得到TRIM31與MAVS

14、的蛋白，免疫共沉淀實驗檢測體外表達(dá)的TRIM31與MAVS的結(jié)合情況。
　　分別構(gòu)建TRIM31的截斷突變體與MAVS的截斷突變體，共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞系，免疫共沉淀實驗檢測TRIM31與MAVS的截斷突變體的結(jié)合情況，尋找TRIM31與MAVS發(fā)生結(jié)合的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域。
　　7.TRIM31對MAVS的泛素化情況
　　將Flag標(biāo)簽的TRIM31過表達(dá)載體、Myc標(biāo)簽的目的分子過表達(dá)載體和HA標(biāo)簽的泛素過表達(dá)載體（W

15、T、K48或K63）共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞系，24小時后提取蛋白，用Myc特異性抗體進(jìn)行免疫共沉淀，Western Blotting檢測TRIM31對目的分子泛素化水平的影響及泛素化形式的影響。
　　構(gòu)建一系列Myc標(biāo)簽的MAVS賴氨酸點突變過表達(dá)載體，分別與Flag標(biāo)簽的TRIM31過表達(dá)載體和HA標(biāo)簽的泛素過表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞系，24小時后提取蛋白，免疫共沉淀技術(shù)檢測TRIM31對不同賴氨酸點突變載體泛素化的影

16、響，探討MAVS上被TRIM31催化形成泛素鏈的賴氨酸位點。
　　提取野生型小鼠和TRIM31敲基因小鼠的腹腔原代巨噬細(xì)胞，SeV感染不同時間點后，提取細(xì)胞蛋白，利用MAVS特異性抗體進(jìn)行免疫共沉淀，Western Blotting方法檢測TRIM31對MAVS內(nèi)源性泛素化水平的影響。
　　將MAVS構(gòu)建到含有T7啟動子的PCDNA3.1-Myc過表達(dá)載體上，將TRIM31構(gòu)建到含有T7啟動子的PCDNA3.1-Flag過表

17、達(dá)載體上，使用Promega公司的體外轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)(TNT Quick Coupled Transcription/Translation System)對表達(dá)載體進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄翻譯，將翻譯的蛋白，加入Boston Biochem公司生產(chǎn)的體外泛素修飾系統(tǒng)（包含E1，UbcH5a，K48, K63，K48R或者K63R等蛋白），室溫反應(yīng)，使用Myc標(biāo)簽抗體進(jìn)行免疫共沉淀，檢測TRIM31對MAVS進(jìn)行in vitro泛素化的情況及泛素化形

18、式。
　　8.TRIM31通過E3連接酶活性影響RLR信號通路
　　構(gòu)建TRIM31泛素連接酶功能缺失點突變載體，利用實時熒光定量PCR技術(shù)，雙熒光素酶報告基因技術(shù)，Western Blotting技術(shù)檢測TRIM31泛素連接酶功能缺失后對RLR信號通路介導(dǎo)的IFN-β產(chǎn)生的影響，對病毒復(fù)制的影響，對MAVS泛素化的影響，以及對MAVS多聚化形成的影響。
　　9.基因恢復(fù)實驗進(jìn)一步證實證明TRIM31通過泛素化MAVS

19、影響RLR介導(dǎo)的信號通路
　　提取TRIM31缺陷MEF細(xì)胞，分別轉(zhuǎn)染空對照載體、野生型TRIM31過表達(dá)載體及E3泛素連接酶功能缺失點突變過表達(dá)載體，用實時熒光定量PCR技術(shù)，雙熒光素酶報告基因技術(shù)，Western Blotting技術(shù)檢測特異性恢復(fù)TRIM31基因表達(dá)后對IFN-β產(chǎn)生的影響，對病毒復(fù)制的影響，對MAVS泛素化的影響，以及對MAVS多聚化形成的影響。
　　10.TRIM31對MAVS形成朊蛋白樣多聚體的影

20、響
　　轉(zhuǎn)染TRIM31過表達(dá)載體于HEK293T細(xì)胞系，或者用TRIM31敲基因小鼠的腹腔原代巨噬細(xì)胞、小鼠胚胎成纖維細(xì)胞，SeV感染不同時間點后，提取細(xì)胞線粒體，直接利用SDD-AGE方法檢測TRIM31過表達(dá)或者缺失后對MAVS朊蛋白樣多聚體形成的影響;或者將提取的SeV預(yù)刺激的線粒體進(jìn)行體外泛素化修飾，反應(yīng)結(jié)束后，再SDD-AGE方法檢測TRIM31對MAVS體外朊蛋白樣多聚體形成的影響。
　　三.實驗結(jié)果
　

21、　1.RNA病毒感染介導(dǎo)TRIM31募集到線粒體上
　　有文獻(xiàn)報道，TRIM31分布于線粒體上及細(xì)胞漿中，為了進(jìn)一步研究RNA病毒感染是否影響TRIM31在線粒體的定位，我們將含有GFP標(biāo)簽的TRIM31過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞中，培養(yǎng)24小時后，再感染SeV6小時，利用線粒體標(biāo)記蛋白作為參照，免疫熒光技術(shù)觀察TRIM31在線粒體上的定位情況。我們發(fā)現(xiàn)SeV病毒感染介導(dǎo)了TRIM31向線粒體上募集。
　　提取C57

22、BL/6小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞，SeV感染不同時間點后，提取線粒體蛋白，用Western Blotting方法檢測TRIM31在線粒體上的含量，我們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞SeV病毒感染后，定位于線粒體上TRIM31蛋白含量明顯增加。以上結(jié)果提示我們RNA病毒感染會引起TRIM31向線粒體的募集。
　　2.TRIM31正向調(diào)控RLR介導(dǎo)的IFN-β的產(chǎn)生進(jìn)而增強天然免疫抗病毒反應(yīng)
　　2.1.TRIM31過表達(dá)促進(jìn)RNA病毒介導(dǎo)的IFN-β的

23、產(chǎn)生
　　為了探究TRIM31是否影響RLR信號通路，在HEK293T細(xì)胞或Hela細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Flag標(biāo)簽的TRIM31過表達(dá)載體，培養(yǎng)24小時后，SeV分別感染4小時、8小時、12小時或轉(zhuǎn)染poly(I∶C)6小時、12小時，實時熒光定量PCR的方法檢測IFN-β mRNA水平的變化，我們發(fā)現(xiàn)TRIM31過表達(dá)后，SeV感染及poly(I∶C)轉(zhuǎn)染引起的IFN-β mRNA水平明顯升高。這預(yù)示著TRIM31正向調(diào)控RLR所介導(dǎo)的

24、IFN-β的產(chǎn)生。
　　2.2.TRIM31干擾抑制RNA病毒介導(dǎo)的IFN-β的產(chǎn)生。
　　為了進(jìn)一步明確TRIM31在RLR信號通路所起的作用，我們合成了TRIM31小鼠源和人源的小干擾RNA，提取小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞，用轉(zhuǎn)染小干擾的方法將降低TRIM31的表達(dá)，SeV分別感染4小時、8小時、12小時，實時熒光定量PCR技術(shù)和ELISA技術(shù)檢測IFN-β產(chǎn)生及分泌。結(jié)果顯示，TRIM31干擾后，SeV感染所介導(dǎo)的IFN-β

25、的在mRNA水平及分泌水平都出現(xiàn)明顯下降，這進(jìn)一步證明了TRIM31可以正向調(diào)控RLR所介導(dǎo)的IFN-β的產(chǎn)生。
　　2.3.TRIM31的抗病毒作用
　　為了研究TRIM31對機體的抗病毒作用，轉(zhuǎn)染TRIM31特異性小干擾RNA或者TRIM31過表達(dá)載體于HEK293T細(xì)胞系，培養(yǎng)24小時候，用含有綠色熒光蛋白的VSV-GFP進(jìn)行感染，實時熒光定量PCR技術(shù)檢測IFN-β的產(chǎn)生和VSVmRNA水平的變化;利用熒光顯微鏡直接

26、觀察病毒的復(fù)制情況;收集細(xì)胞上清，進(jìn)行病毒空斑實驗檢測病毒滴度。我們發(fā)現(xiàn)TRIM31干擾后，VSV感染引起IFN-βmRNA水平表達(dá)明顯下降，進(jìn)而使得VSV病毒逃逸并大量復(fù)制。病毒空斑實驗同樣發(fā)現(xiàn)TRIM31干擾組中VSV病毒滴度明顯升高。相反的，過表達(dá)TRIM31之后，VSV介導(dǎo)的IFN-β mRNA水平的產(chǎn)生明顯升高，VSV病毒mRNA水平明顯下降，熒光顯微鏡觀察病毒的復(fù)制能力減弱，病毒空斑實驗證明TRIM31過表達(dá)組的VSV病毒滴

27、度明顯下降。由此我們可以看到TRIM31在機體抗病毒中起著十分重要的作用。
　　3.TRIM31抗病毒的生理意義
　　3.1.TRIM31缺陷抑制RNA病毒引起的IFN-β產(chǎn)生
　　為了進(jìn)一步驗證TRIM31在RLR信號通路中所起的作用及TRIM31抗病毒的生理意義，我們構(gòu)建了TRIM31特異性敲基因小鼠，提取野生型小鼠和TRIM31敲基因小鼠的腹腔原代巨噬細(xì)胞，分別使用LPS、Poly(I∶C)等TLR通路配體刺激細(xì)

28、胞，SeV、VSV等RLR通路配體感染細(xì)胞，HSV-1等DNA配體感染細(xì)胞，實時熒光定量PCR方法檢測IFN-β及IFN相關(guān)基因ISGs的表達(dá)差異，我們發(fā)現(xiàn)SeV感染或5'ppp-RNA轉(zhuǎn)染后，TRIM31敲基因小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞所表達(dá)的IFN-β以及IFN-β相關(guān)基因如Ccl5、Cxcl10的表達(dá)明顯下降。而使用LPS、Poly(I∶C)刺激或HSV-1感染的野生型小鼠和TRIM31敲基因小鼠的腹腔原代巨噬細(xì)胞所表達(dá)的IFN-β以及

29、IFN-β相關(guān)基因無明顯變化差異。我們分別提取野生型小鼠和TRIM31敲基因小鼠的胚胎成纖維細(xì)胞或者骨髓來源巨噬細(xì)胞，重復(fù)上面的實驗，得到相似的結(jié)論。這說明TRIM31特異性敲除可以明顯抑制RNA病毒介導(dǎo)的Ⅰ型干擾素的生成，而對TLR信號通路等沒有影響。
　　3.2.TRIM31敲基因小鼠更易于感染RNA病毒
　　由于Ⅰ型干擾素與病毒的復(fù)制、清除有著直接關(guān)系，我們進(jìn)一步研究了TRIM31在機體抵抗病毒復(fù)制方面的生理意義，提取

30、野生型小鼠和TRIM31敲基因小鼠的腹腔原代巨噬細(xì)胞，然后用VSV或HSV-1進(jìn)行感染，實時熒光定量PCR技術(shù)檢測IFN-β和VSV在mRNA水平的變化;收集細(xì)胞上清，利用病毒空斑實驗檢測病毒滴度差異。收取細(xì)胞蛋白，Western Blotting方法檢測VSV蛋白水平的表達(dá)差異。我們發(fā)現(xiàn)與野生小鼠相比較，TRIM31敲基因小鼠被VSV感染后產(chǎn)生IFN-β在mRNA水平明顯下降，而VSV在mRNA水平則明顯升高;病毒空斑實驗顯示TRIM

31、31敲基因小鼠VSV病毒滴度明顯升高。
　　我們通過腹腔注射VSV病毒的方法建立小鼠的RNA病毒感染模型，觀察小鼠的死亡率，繪制小鼠生存曲線，發(fā)現(xiàn)TRIM31敲基因小鼠在病毒感染后的死亡率更高;小鼠眼球取血得到血清，ELISA方法檢測TRIM31敲基因小鼠感染后血清中IFN-β的產(chǎn)量明顯低于野生型小鼠;處死小鼠后取肝臟、脾臟和肺臟，提取組織總RNA和蛋白，實時熒光定量PCR方法檢測到TRIM31敲基因小鼠感染后的肝臟、脾臟和肺臟中

32、IFN-β的表達(dá)明顯低于野生型小鼠，而VSV的mRNA則明顯高于野生型小鼠;Western Blotting方法檢測同樣發(fā)現(xiàn)TRIM31敲基因小鼠感染后各組織中VSV蛋白含量也是明顯高于野生型小鼠;肝臟、脾臟和肺臟等組織研磨得到上清，病毒空斑實驗檢測病毒滴度，發(fā)現(xiàn)TRIM31敲基因小鼠感染后的病毒滴度明顯高于野生型小鼠;取小鼠肺臟組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)及HE染色，觀察肺損傷情況，發(fā)現(xiàn)TRIM31敲基因小鼠病毒感染后肺損傷比野生型小鼠更加嚴(yán)

33、重。以上結(jié)果說明相比于野生型小鼠，TRIM31敲基因小鼠更容易感染RNA病毒。我們通過腹腔注射HSV-1病毒的方法建立小鼠的DNA病毒感染模型重復(fù)以上實驗，則發(fā)現(xiàn)，野生型小鼠和TRIM31敲基因小鼠在抵抗DNA病毒的過程中沒有明顯的差異。
　　4.TRIM31對RLR信號通路活化的影響
　　RLR信號通路活化后可以引起TBK1的自身磷酸化及激酶活性的激活，進(jìn)而引起IRF3的磷酸化，磷酸化后的IRF3發(fā)生二聚化并入核，結(jié)合到I

34、FN的啟動子區(qū)域，引起IFN-β的產(chǎn)生。因此，TBK1的磷酸化及IRF3的磷酸化、二聚化、入核代表RLR信號通路的活化。我們轉(zhuǎn)染TRIM31過表達(dá)載體于HEK293T細(xì)胞系，分別用SeV感染4小時、8小時、12小時，Western Blotting檢測發(fā)現(xiàn)TRIM31過表達(dá)后病毒介導(dǎo)的TBK-1和IRF3磷酸化明顯增強，IRF3進(jìn)入細(xì)胞核中的含量也明顯增加，利用非變性Western Blotting發(fā)現(xiàn)過表達(dá)TRIM31可以促進(jìn)病毒介導(dǎo)

35、的IRF3二聚體的形成。利用雙熒光素酶報告基因技術(shù)檢測IRF3活性的變化，將IRF3的報告基因與TRIM31過表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T，SeV感染后，我們發(fā)現(xiàn)過表達(dá)TRIM31明顯促進(jìn)病毒介導(dǎo)的IRF3的報告基因的活性。利用DNA病毒HSV-1感染細(xì)胞，利用以上手段發(fā)現(xiàn)TRIM31過表達(dá)并未影響DNA病毒介導(dǎo)的TBK1、IRF3的磷酸化。
　　提取野生型小鼠和TRIM31敲基因小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞，分別用SeV感染細(xì)胞，Wes

36、tern Blotting檢測手段發(fā)現(xiàn)TRIM31敲除后SeV介導(dǎo)的TBK-1和IRF3磷酸化明顯減弱，IRF3進(jìn)入細(xì)胞核中的含量也明顯減少，利用非變性WesternBlotting發(fā)現(xiàn)TRIM31敲除可以抑制IRF3二聚體的形成。利用DNA病毒HSV-1感染細(xì)胞，重復(fù)上述實驗，發(fā)現(xiàn)HSV-1介導(dǎo)的TBK1及IRF3的活化并未受到影響。以上結(jié)果從多個層次說明TRIM31特異性促進(jìn)RLR信號通路的活化，而對DNA病毒介導(dǎo)的信號通路活化沒有

37、影響。
　　5.TRIM31靶分子的尋找
　　前面結(jié)果表明TRIM31促進(jìn)RNA病毒引起的IFN-β的產(chǎn)生，對病毒的復(fù)制起著明顯的抑制作用。那么TRIM31是如何影響RLR所介導(dǎo)的信號通路的，具體的作用靶點是什么。接下來，我們將RLR信號通路中相關(guān)的接頭分子RIG-Ⅰ、MDA5、MAVS、TBK1、IKKε、IRF3-5D等接頭蛋白的過表達(dá)載體與TRIM31表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞系，利用實時熒光定量PCR及雙熒光素

38、酶報告基因技術(shù)檢測TRIM31對不同接頭蛋白所介導(dǎo)的IFN-β mRNA產(chǎn)生及報告基因活性的影響，我們發(fā)現(xiàn)TRIM31過表達(dá)明顯可以促進(jìn)RIG-Ⅰ、MDA5、MAVS接頭蛋白所介導(dǎo)的IFN-β mRNA的產(chǎn)生以及IFN-β報告基因活性，而對接頭TBK1、IKKε、IRF3-5D介導(dǎo)的IFN-β的產(chǎn)生沒有影響。結(jié)合之前我們發(fā)現(xiàn)TRIM31在RNA病毒感染后可以募集到線粒體上的現(xiàn)象，提示我們TRIM31作用靶點有可能是MAVS。為了進(jìn)一步驗

39、證這一假設(shè)，我們將RIG-Ⅰ、MDA5、MAVS、TBK1、IKKε、IRF3-5D等接頭蛋白的過表達(dá)載體與TRIM31過表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞系，免疫共沉淀實驗檢測TRIM31與各接頭分子的結(jié)合情況，結(jié)果顯示TRIM31與MAVS有明顯結(jié)合作用，而與其他接頭分子沒有結(jié)合作用。因此我們得出結(jié)論TRIM31可能通過靶向MAVS進(jìn)而調(diào)控RLR所介導(dǎo)的信號通路。
　　6.TRIM31的coiled-coil結(jié)構(gòu)域與MAVS的p

40、roline-rich結(jié)構(gòu)域相結(jié)合
　　為了更加細(xì)致深入的研究TRIM31與MAVS的結(jié)合情況，我們進(jìn)一步檢測了它們內(nèi)源性的結(jié)合情況，提取小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞，SeV感染不同時間點，用內(nèi)源性TRIM31抗體進(jìn)行免疫共沉淀實驗，檢測內(nèi)源性TRIM31與MAVS的結(jié)合，我們觀察到隨著病毒感染時間的增加，TRIM31與MAVS結(jié)合也逐漸增強，兩者的結(jié)合存在時間依賴性。為了進(jìn)一步驗證兩者是否是直接性結(jié)合，我們利用體外翻譯系統(tǒng)，過表達(dá)TRI

41、M31與MAVS的蛋白，免疫共沉淀實驗檢測發(fā)現(xiàn)外源性表達(dá)TRIM31與MAVS發(fā)生了直接結(jié)合。為了探究TRIM31與MAVS發(fā)生結(jié)合的具體結(jié)構(gòu)域，我們構(gòu)建了一系列TRIM31與MAVS的截斷突變體，將各截斷體共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞系，免疫共沉淀實驗檢測TRIM31與MAVS的截斷突變體的結(jié)合情況，實驗表明TRIM31的coiled-coil結(jié)構(gòu)域與MAVS的proline-rich結(jié)構(gòu)域在TRIM31與MAVS的結(jié)合過程中起著重要的作

42、用。
　　7.TRIM31對MAVS的泛素化實驗
　　TRIM31屬于TRIM家族，是E3泛素連接酶的一種，因此我們想進(jìn)一步明確TRIM31對MAVS是否進(jìn)行了泛素化修飾。我們將Flag標(biāo)簽的TRIM31過表達(dá)載體，Myc標(biāo)簽MAVS過表達(dá)載體和HA標(biāo)簽的泛素表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞系，培養(yǎng)24小時后提取蛋白，用Myc特異性抗體進(jìn)行免疫共沉淀，WesternBlotting結(jié)果顯示TRIM31可以促進(jìn)MAVS的K63

43、位泛素化修飾。MAVS分子上共有14個賴氨酸位點，為了詳細(xì)闡明TRIM31對其中哪個氨基酸位點進(jìn)行了泛素化修飾，我們構(gòu)建了一系列MAVS賴氨酸點突變過表達(dá)載體，與TRIM31過表達(dá)載體及泛素過表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞系，免疫共沉淀技術(shù)及Western Blotting技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)TRIM31主要將MAVS上的第10位，第311位，第461位賴氨酸進(jìn)行K63位泛素化修飾。提取野生型小鼠和TRIM31敲基因小鼠的腹腔原代巨噬細(xì)胞

44、，SeV感染不同時間點，提取細(xì)胞蛋白，利用MAVS內(nèi)源性抗體進(jìn)行免疫共沉淀，Western Blotting技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)TRIM31敲除后SeV介導(dǎo)的MAVS內(nèi)源性K63位泛素化水平明顯下降，而TRIM31對MAVS的K48位泛素化修飾無明顯影響。我們進(jìn)一步通過體外蛋白翻譯系統(tǒng)和體外泛素化系統(tǒng)，檢測TRIM31對MVAS的體外泛素化修飾情況，結(jié)果表明TRIM31可以在體外系統(tǒng)直接促進(jìn)MAVS的K63位泛素化修飾。以上結(jié)果表明，E3泛素連

45、接酶TRIM31可以將MAVS的第10位，第311位，第461位賴氨酸進(jìn)行K63位泛素化修飾。
　　8.TRIM31通過其E3泛素連接酶功能對RLR信號通路的影響
　　為了進(jìn)一步驗證TRIM31是否通過其E3泛素連接酶功能影響RLR信號通路，我們構(gòu)建了TRIM31泛素連接酶功能缺失點突變過表達(dá)載體，通過實時熒光定量PCR技術(shù)、雙熒光素酶報告基因技術(shù)、Western Blotting技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)缺失了E3泛素連接酶功能后，TR

46、IM31對RLR信號通路介導(dǎo)的IFN-β的產(chǎn)生失去了促進(jìn)作用，TRIM31的抗病毒作用也隨即消失。以上結(jié)論說明TRIM31通過其E3泛素連接酶活性促進(jìn)RLR介導(dǎo)的Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生及抗病毒作用。
　　9.TRIM31促進(jìn)MAVS的多聚化
　　TRIM31對MAVS進(jìn)行K63位泛素化修飾的機制我們已做了大量研究，然而TRIM31對MAVS修飾后如何調(diào)控MAVS的功能是我們進(jìn)一步要探討的重要問題。已有文章報道MAVS在RNA病毒感

47、染后形成朊蛋白樣多聚體，該多聚體的形成對于MAVS進(jìn)一步活化下游信號通路起到至關(guān)重要的作用，然而MAVS如何形成朊蛋白樣多聚體還不得而知。因此我們進(jìn)行實驗驗證TRIM31對MAVS的K63泛素化修飾是否促進(jìn)MAVS多聚體的形成。我們分別轉(zhuǎn)染空載體及TRIM31過表達(dá)載體于HEK293T細(xì)胞系，SeV感染不同時間點后，提取細(xì)胞線粒體，利用SDD-AGE技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)TRIM31過表達(dá)明顯促進(jìn)SeV介導(dǎo)的MAVS多聚體的形成。我們進(jìn)一步提取S

48、eV預(yù)刺激后巨噬細(xì)胞的線粒體，與體外翻譯得到的TRIM31蛋白共同加入體外泛素化系統(tǒng)，反應(yīng)結(jié)束后，SDD-AGE檢測發(fā)現(xiàn)TRIM31體外明顯促進(jìn)SeV介導(dǎo)的MAVS多聚體的形成。提取野生型小鼠和TRIM31敲基因小鼠的腹腔原代巨噬細(xì)胞，SeV感染不同時間點，提取線粒體蛋白，SDD-AGE技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)TRIM31敲除后明顯抑制SeV介導(dǎo)的MAVS多聚體的形成。以上實驗表明TRIM31可以促進(jìn)MAVS朊蛋白樣多聚化的形成，進(jìn)而影響MAVS的

49、活化及IFN-β的產(chǎn)生。
　　10.基因恢復(fù)實驗證明TRIM31特異性調(diào)控MAVS活化及RLR介導(dǎo)的信號通路
　　我們提取TRIM31敲基因小鼠MEF細(xì)胞，分別轉(zhuǎn)染空載體及TRIM31過表達(dá)載體，SeV或VSV感染細(xì)胞，分別使用實時熒光定量PCR技術(shù)，雙熒光素酶報告基因技術(shù)，ELISA技術(shù)，Western Blotting技術(shù)進(jìn)行檢測，我們發(fā)現(xiàn)TRIM31基因敲除后SeV誘導(dǎo)的MAVS形成朊蛋白樣多聚體的能力減弱，IFN-β

50、產(chǎn)生減少，病毒復(fù)制明顯增加;重新過表達(dá)TRIM31后，由TRIM31缺陷導(dǎo)致的對RLR信號通路及病毒復(fù)制的影響隨即消失。以上結(jié)果進(jìn)一步證明了TRIM31對于RLR介導(dǎo)信號通路的影響。
　　我們同樣利用基因恢復(fù)實驗進(jìn)一步驗證了MAVS的K63位泛素化對RLR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程的影響，在MAVS特異性敲除MEF細(xì)胞中，重新轉(zhuǎn)染野生型MAVS過表達(dá)載體、K10、K311、K461位賴氨酸位點突變MAVS過表達(dá)載體與野生型TRIM31過表達(dá)載體

51、、E3連接酶功能缺失點突變過表達(dá)載體載體，SeV或VSV感染一系列時間點，利用實時熒光定量PCR，雙熒光素酶報告基因技術(shù)，WesternBlotting技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，MAVS敲除后，SeV介導(dǎo)的RLR信號通路被阻斷，重新轉(zhuǎn)染野生型MAVS后，RLR介導(dǎo)的Ⅰ型干擾素產(chǎn)生得到恢復(fù);TRIM31過表達(dá)促進(jìn)RLR介導(dǎo)的Ⅰ型干擾素的生成;然而轉(zhuǎn)染K10、K311、K461位賴氨酸位點突變MAVS表達(dá)載體后，RLR介導(dǎo)的信號通路的阻斷不能得到恢復(fù)。

52、以上結(jié)果說明TRIM31對于MAVS的K10、K311、K461位賴氨酸位點的K63位泛素化直接影響MAVS活化及RLR信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)。
　　四.結(jié)論及創(chuàng)新性
　　1.首次證明了TRIM31在RLR信號通路中發(fā)揮作用
　　TRIM31屬于TRIM家族中的一員，已有研究表明TRIM31在消化系統(tǒng)相關(guān)癌癥中發(fā)揮著重要作用。然而TRIM31是否參與到天然免疫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)目前還沒有報道。我們首先發(fā)現(xiàn)了TRIM31在RNA病毒介導(dǎo)的

53、天然免疫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及機體抗病毒反應(yīng)中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。
　　2.首次發(fā)現(xiàn)了對MAVS進(jìn)行K63位泛素化修飾的分子
　　對于MAVS的泛素化修飾大多集中在K48位泛素化修飾，至今仍未發(fā)現(xiàn)對MAVS發(fā)生K63位泛素化修飾的分子，我們的發(fā)現(xiàn)填補了這一空白。我們發(fā)現(xiàn)TRIM31促進(jìn)IFN-β的產(chǎn)生，這一現(xiàn)象是通過其E3泛素連接酶對MAVS進(jìn)行K63位泛素化修飾引起的;同時我們明確了對TRIM31對MAVS泛素化修飾的位點，分別是M

54、AVS第10位，第311位，第461位賴氨酸。
　　3.為探索影響MAVS多聚化形成的因素提供了新思路
　　MAVS作為RLR信號通路重要的接頭蛋白，RNA病毒感染機體后，MAVS構(gòu)象發(fā)生改變，形成朊蛋白樣多聚體，該多聚體的形成是MAVS活化下游信號通路的前提條件，然而對于MAVS多聚化形成的調(diào)節(jié)機制并不明確。我們研究發(fā)現(xiàn)，SeV感染后，TRIM31募集到線粒體上，并與MAVS結(jié)合并促進(jìn)MAVS發(fā)生K63位泛素化修飾，這種K