豬流感病毒感染中線粒體蛋白MAVS介導(dǎo)的宿主天然免疫效應(yīng).pdf

1、豬流感是由豬流感病毒引起的一種豬的急性呼吸道傳染病，病毒的基因組為分節(jié)段的單股負鏈RNA，這一特點使病毒能通過基因突變和基因重配不斷進化，從而逃避宿主的免疫壓力。探究機體感染豬流感病毒后的天然免疫變化和宿主蛋白的抗病毒作用具有重要的理論意義。
　　1.豬流感病毒感染對豬肺泡巨噬細胞天然免疫信號通路的影響
　　從35日齡健康仔豬肺部分離肺泡巨噬細胞，以MOI=5感染H3N2豬流感病毒A/Swine/Shandong/3/200

2、5，間接免疫熒光試驗發(fā)現(xiàn)豬流感病毒能夠在豬原代肺泡巨噬細胞中增殖。熒光定量RT-PCR方法檢測結(jié)果顯示，TLR-3、TLR-7、RIG-Ⅰ、MDA-5的mRNA在感染后6-24h均出現(xiàn)顯著升高(p＜0.05); IRF-7、IFN-β的mRNA在感染后8-24h顯著升高(p＜0.05);MyD88和MAVS mRNA在感染后8h升高，12h后又開始緩慢下降。放射性免疫方法檢測上清中細胞因子的含量，其中IL-1β、TNF-α分別在感染后6

3、h和8h出現(xiàn)峰值;IFN-α及IFN-β在病毒感染6-8h后顯著升高，至24h時仍維持較高水平(p＜0.05)。結(jié)果表明，該豬流感病毒毒株能夠在豬肺泡巨噬細胞中有效增殖，且能激活TLR及RLR信號通路中相關(guān)受體及效應(yīng)因子的基因與蛋白表達。
　　2.豬流感病毒感染對上皮細胞系A(chǔ)549天然免疫信號通路的影響
　　人肺癌上皮細胞系A(chǔ)549以MOI=5感染H3N2豬流感病毒，結(jié)果發(fā)現(xiàn)豬流感病毒能夠在A549細胞上有效增殖，感染后48

4、h，毒價可達106.1TCID50/mL。熒光定量RT-PCR檢測結(jié)果顯示， TLR-3、TLR-7、RIG-Ⅰ、MDA-5的mRNA水平在感染后6h均開始顯著升高(p＜0.05)。IRF-7、IFN-α及IFN-β mRNA在感染后8-24h顯著升高(p＜0.05)。MyD88和MAVS mRNA在8h時升高，12h后又開始緩慢下降，至24h時與對照組無顯著差異(p＞0.05)。Western blot分析發(fā)現(xiàn)RIG-Ⅰ、TLR-3、

5、TLR-7等蛋白表達水平在病毒感染后升高，而MAVS在感染后降低。此外，雙熒光素酶報告試驗發(fā)現(xiàn)poly I∶C刺激或SIV感染后，能顯著誘導(dǎo)IFN-β啟動子、IRF3/7結(jié)合位點、NF-κB結(jié)合位點報告質(zhì)粒的熒光素酶表達。結(jié)果表明，該豬流感病毒毒株能夠在A549細胞中增殖，且能夠有效激活TLR及RLR介導(dǎo)的天然免疫信號通路。A549細胞系可以作為研究豬流感病毒感染后宿主細胞天然免疫變化的體外細胞模型。
　　3.MAVS通過介導(dǎo)IF

6、N-Ⅰ的產(chǎn)生抑制豬流感病毒的增殖
　　在pCMV-Flag-MAT-TAG-MAVS質(zhì)粒的基礎(chǔ)上構(gòu)建各種MAVS截斷突變質(zhì)粒，通過過表達試驗發(fā)現(xiàn)MAVS能顯著激活I(lǐng)FN-β啟動子活性，進而抑制病毒的增殖，且呈劑量依賴性。當(dāng)缺失CARD結(jié)構(gòu)或者跨膜區(qū)時，MAVS幾乎不能誘導(dǎo)IFN-β啟動子或NF-κ B、IRF-3/7結(jié)合位點的活化，且對病毒滴度幾乎無抑制效果;缺失脯氨酸富集區(qū)的突變質(zhì)粒對其功能的影響不顯著，但其活性低于完整的MAV

7、S(p＞0.05)。表明CARD結(jié)構(gòu)或跨膜區(qū)對MAVS介導(dǎo)的IFN-Ⅰ的產(chǎn)生至關(guān)重要。通過人工合成的siRNA序列抑制A549細胞的內(nèi)源性MAVS表達，再次感染豬流感病毒，結(jié)果發(fā)現(xiàn)病毒誘導(dǎo)的IFN-β啟動子的活化受到顯著抑制，病毒滴度顯著升高(p＜0.05)，表明MAVS對宿主細胞IFN-Ⅰ抗病毒通路的活化是必需的，提示線粒體可能在宿主的天然免疫通路中發(fā)揮重要作用。
　　4.MAVS介導(dǎo)病毒引起的細胞凋亡
　　在pCMV-F

8、lag-MAT-TAG-MAVS質(zhì)粒的基礎(chǔ)上構(gòu)建各種MAVS截斷突變質(zhì)粒，通過過表達試驗發(fā)現(xiàn)MAVS能顯著促進細胞凋亡，且呈劑量依賴性(p＜0.05)。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，在MAVS過表達細胞中，Caspase-9、Caspase-3等凋亡相關(guān)蛋白的表達水平顯著升高(p＜0.05)。缺失CARD結(jié)構(gòu)或跨膜區(qū)時，凋亡比率顯著降低(p＜0.05)，而缺失脯氨酸富集區(qū)對細胞凋亡的影響不顯著(p＞0.05)。通過特異性siRNA抑

9、制細胞內(nèi)源性MAVS的表達后，再次感染豬流感病毒，結(jié)果發(fā)現(xiàn)病毒感染引起的細胞凋亡比率顯著下降(p＜0.05)，表明MAVS對豬流感病毒感染導(dǎo)致的細胞凋亡的發(fā)生是必不可少的。通過Transwell小室試驗發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染MAVS能引起凋亡細胞比例顯著升高，而處于同樣培養(yǎng)環(huán)境的對照轉(zhuǎn)染細胞未出現(xiàn)細胞凋亡，表明MAVS介導(dǎo)的凋亡不是IFN-Ⅰ的副效應(yīng)，與IFN-Ⅰ的產(chǎn)生是獨立發(fā)揮作用的。研究提示，MAVS介導(dǎo)的凋亡途徑在宿主抗病毒感染中可能發(fā)揮著重要

10、的作用。
　　5.豬流感病毒相關(guān)蛋白對MAVS介導(dǎo)的IFN-Ⅰ產(chǎn)生及凋亡的影響
　　將豬流感病毒A/Swine/Shandong/3/2005(H3N2)的NS1、PB1-F2及NP表達質(zhì)粒，分別與MAVS全長表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染A549細胞，通過雙熒光素酶報告系統(tǒng)研究發(fā)現(xiàn)NS1、PB1-F2能顯著降低MAVS誘導(dǎo)的IFN-β啟動子活性(p＜0.05)，且NS1抑制MAVS介導(dǎo)的IFN-β啟動子的活性呈劑量依賴性;流式細胞術(shù)檢測結(jié)

11、果顯示NS1蛋白能顯著拮抗MAVS介導(dǎo)的凋亡的產(chǎn)生，并呈顯著的劑量依賴性(p＜0.05)，而PB1-F2、NP蛋白對MAVS介導(dǎo)的凋亡的抑制作用不顯著(p＞0.05);MAVS過表達能顯著抑制病毒的增殖，共表達NS1質(zhì)粒后，病毒滴度顯著升高(p＜0.05);共表達PB1-F2、NP質(zhì)粒也能引起病毒滴度的升高，但差異不顯著(p＞0.05)。研究結(jié)果表明， NS1能夠拮抗MAVS介導(dǎo)的IFN-Ⅰ產(chǎn)生及細胞凋亡，為深入認識豬流感病毒逃避宿主細