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1、樹突狀細(xì)胞(Dendritic cell,DC)作為體內(nèi)功能最強(qiáng)的專職抗原提呈細(xì)胞,主要依賴其表面的Toll樣受體(Toll liker eceptors,TLRs)識(shí)別病原微生物,誘導(dǎo)固有免疫(innate immunity)應(yīng)答,激活特異性免疫應(yīng)答。Toll樣受體7(Toll like receptor 7,TLR7)是近年發(fā)現(xiàn)的一類特殊的TLRs,廣泛存在于體內(nèi)免疫細(xì)胞中,尤以DC為著。業(yè)已證實(shí),TLR7主要作為某些小分子抗病毒化
2、合物和病毒單鏈RNA(single strand RNA,ssRNA)分子的模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors,PRR),介導(dǎo)DC發(fā)揮免疫應(yīng)答效應(yīng)。迄今為止,人們對(duì)TLR7的亞細(xì)胞定位及其識(shí)別配體后介導(dǎo)的免疫效應(yīng)尚不完全清楚。因此,對(duì)TLR7的深入研究,將進(jìn)一步揭示機(jī)體抗感染免疫的分子機(jī)制。
為了解DC中TLR7介導(dǎo)的免疫反應(yīng),本課題采用小鼠永生化的樹突狀細(xì)胞系DC2.4為細(xì)胞模型,檢測(cè)了
3、DC2.4中TLR7和TLR4的表達(dá)及TLR7識(shí)別配體Imiquimod后介導(dǎo)的DC免疫應(yīng)答效應(yīng)。
本課題的研究?jī)?nèi)容和實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
1.DC2.4中TLR7基因和蛋白表達(dá)檢測(cè)
根據(jù)Genebank中的小鼠TLR7和β-actin基因全序列,分別設(shè)計(jì)相應(yīng)上、下游引物各一對(duì),用反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)檢測(cè)DC2.4中TLR7mRNA表達(dá),Western blot檢測(cè)DC2.4中TLR7蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示,
4、DC2.4中TLR7只有mRNA轉(zhuǎn)錄,檢測(cè)不到蛋白表達(dá)。
2.DC2.4中TLR4蛋白表達(dá)檢測(cè)
在放有蓋玻片的六孔板中,用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)DC2.4,待蓋玻片上細(xì)胞長(zhǎng)至約50~60%時(shí),用間接免疫熒光法檢測(cè)DC2.4中TLR4蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示,DC2.4細(xì)胞膜表面可檢測(cè)到TLR4蛋白表達(dá)。
3.TLR4的配體——LPS刺激DC2.4,誘導(dǎo)TLR7蛋白的表達(dá)
培養(yǎng)DC2
5、.4至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,培養(yǎng)液中加入LPS(1mg/L),分別在12h、24h、48h、72h收集細(xì)胞,提取蛋白,以未加入LPS組為陰性對(duì)照,胎盤組織提取蛋白為陽(yáng)性對(duì)照,用Westernblot檢測(cè)蛋白表達(dá)情況。結(jié)果表明,LPS刺激DC2.4后12h,可檢測(cè)到TLR7蛋白的表達(dá),但72h后未能檢測(cè)到。陰性對(duì)照組無(wú)TLR7蛋白表達(dá),陽(yáng)性對(duì)照組有明顯的TLR7蛋白表達(dá)。4.TLR7識(shí)別配體Imiquimod介導(dǎo)的DC免疫應(yīng)答效應(yīng)
將DC
6、2.4按1×108/L接種于96孔板,共分4組,每組均設(shè)復(fù)孔。設(shè)L0組為陰性對(duì)照組,L組加入LPS(1mg/L),I組加入抗病毒化合物Imiquimod(10mol/L),LI組先加入LPS(1mg/L),12h后加入Imiquimod(10mol/L)。培養(yǎng)12h后收獲各組細(xì)胞培養(yǎng)上清,離心后用ELISA方法檢測(cè)IL-12和IFN-α表達(dá)水平,操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。數(shù)據(jù)采用SPSS11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。結(jié)果顯示,Imiqu
7、imod刺激表達(dá)TLR7蛋白的DC2.4后,IL-12分泌顯著增加,IFN-α分泌無(wú)顯著變化。
結(jié)論:
1.在DC2.4中有TLR4蛋白和TLR7mRNA表達(dá),但檢測(cè)不到TLR7蛋白表達(dá)。
2.TLR4天然配體LPS刺激12h后,可誘導(dǎo)DC2.4表達(dá)TLR7蛋白,但72h后未能檢測(cè)到蛋白表達(dá)。
3.在DC2.4中,誘導(dǎo)表達(dá)的TLR7蛋白分子可以識(shí)別配體Imiquimod,激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,介導(dǎo)DC
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