戊型肝炎病毒4型ORF2片段在昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá).pdf

1、戊型肝炎病毒（HEV）為無包膜的單股正鏈 RNA病毒，基因組全長約7200bp，有3個開放讀碼框架（ORFs）：ORF1、ORF2和ORF3。感染哺乳動物的HEV主要有4個基因型，只有一個血清型。
　　昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)具備許多真核系統(tǒng)翻譯后加工功能，如二硫鍵的形成、糖基化、磷酸化、信號肽切除等。應(yīng)用其不但能表達(dá)大分子蛋白還可以同時表達(dá)多個外源基因，形成多聚體蛋白。表達(dá)出的重組蛋白具有天然蛋白的生物學(xué)功能，最高表達(dá)量可達(dá)細(xì)胞總蛋

2、白量的50％。
　　利用昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的HEV ORF2蛋白能自主組裝成病毒樣顆粒（VLPs），這些VLPs不僅在形態(tài)大小上與天然的病毒顆粒非常相似，而且免疫原性與完整的HEV類似，為戊型肝炎疫苗及診斷試劑的研究奠定了基礎(chǔ)。
　　本課題針對戊型肝炎病毒（HEV）4型ORF2編碼第126-621位氨基酸的基因進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，構(gòu)建克隆，并應(yīng)用昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)。對所表達(dá)的蛋白進(jìn)行純化分析，電鏡觀察確定是否形

3、成病毒樣顆粒。
　　一．重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建與鑒定
　　為了提高病毒樣顆粒的產(chǎn)量，對HEV ORF2基因進(jìn)行 PCR擴(kuò)增時引入Kozak序列。以本室構(gòu)建的質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增得到優(yōu)化后的目的基因，經(jīng)過酶切連接最終得到pFastBac1重組載體，經(jīng)過DNA測序驗證序列及讀碼框正確。
　　二．病毒樣顆粒的表達(dá)與純化
　　利用Bac-to-Bac表達(dá)系統(tǒng)，在 Sf9昆蟲細(xì)胞內(nèi)表達(dá)目的基因。ELISA與Weste