利用桿狀病毒表達系統(tǒng)表面展示丙型肝炎病毒結(jié)構(gòu)蛋白.pdf

1、目的：
　　 將丙型肝炎病毒(HCV)的核心蛋白Core，包膜蛋白E以及CE融合蛋白通過Bac-to-Bac系統(tǒng)構(gòu)建重組Bacmids，然后轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞Sf9獲得重組桿狀病毒，通過免疫熒光和Western-blot檢測蛋白在細(xì)胞中的表達情況；構(gòu)建HCV核心蛋白Core的原核表達載體，經(jīng)誘導(dǎo)表達和純化得到目的蛋白；為后續(xù)進行HCV的檢測以及利用桿狀病毒載體的特點進行HCV疫苗研究奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1、

2、構(gòu)建重組的載體pFBD-F-C，pFBD-F-E，pFBD-F-CE。將已有的正確的T-C、T-E和T-CE通過酶切、連接、轉(zhuǎn)化，將其分別構(gòu)建到pFBD-GFP載體上。
　　 2、重組的Bacmid(Ac-FBD-F-C，Ac-FBD-F-E，Ac-FBD-F-CE)的獲得。利用Bac-to-Bac系統(tǒng)，將重組載體(pFBD-F-C，pFBD-F-E，pFBD-F-CE)轉(zhuǎn)化到DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，在helper質(zhì)粒的作用下

3、，經(jīng)重組獲得重組Bacmid，并用PCR對重組的Bacmid進行檢測。
　　 3、重組桿狀病毒的獲得和擴增及鑒定。將重組的Bacmid質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，獲得重組的桿狀病毒(vAc-FBD-F-C，vAc-FBD-F-E，vAc-FBD-F-CE)，將重組的桿狀病毒感染Sf9細(xì)胞72h，得到擴增后的重組桿狀病毒和感染后的細(xì)胞，經(jīng)免疫熒光染色后激光共聚焦顯微鏡觀察，Western-blot檢測其在細(xì)胞中的表達。
　　 4、

4、原核表達載體pET32a-FDSC的構(gòu)建及鑒定。分別以EcoRⅠ/NotⅠ雙酶酶切T-FDSC，將650bp的酶切片段克隆至pET32a的EcoRⅠ/NotⅠ位點，轉(zhuǎn)化感受態(tài)受體菌E.coliDH5α，并酶切鑒定。
　　 5、原核表達載體pET32a-FDSC誘導(dǎo)條件的優(yōu)化及目的蛋白的純化和鑒定。將重組質(zhì)粒pET32a-FDSC轉(zhuǎn)化到感受態(tài)受體菌E.coli.BL21(DE3)細(xì)胞，IPTG誘導(dǎo)目的蛋白表達；并從IPTG的誘導(dǎo)濃

5、度，誘導(dǎo)的溫度和時間三個方面優(yōu)化表達條件，Ni-NTA親和層析柱純化表達的蛋白，SDS-PAGE電泳分析，Western-blot驗證。
　　 結(jié)果：
　　 1、重組載體pFBD-F-C，pFBD-F-E，pFBD-F-CE的構(gòu)建及鑒定結(jié)果：重組載體pFBD-F-C（SalⅠ+PstⅠ），pFBD-F-E(PstⅠ+XbalⅠ),pFBD-F-CE(Pstl+XbalⅠ)，經(jīng)雙酶酶切后電泳顯示在大小約2.23kb、3.2

6、3kb、3.83kb處呈現(xiàn)明顯的條帶，表示成功的將HCV的C、E和CE插入到載體pFBD-GFP中。
　　 2、經(jīng)過Bac-to-Bac系統(tǒng)的同源重組獲得重組的Bacmid，PCR后電泳在3.3kb，4.36kb，4.96kb處可見特異性條帶，PCR結(jié)果表明成功的將HCV的C，E和CE插入到桿狀病毒的Tn7的左右臂之間，獲得了重組的桿狀病毒。
　　 3、重組的桿狀病毒感染Sf9細(xì)胞72h后，免疫熒光染色觀察發(fā)現(xiàn)在感染后的

7、Sf9細(xì)胞上均可以檢測到紅色和綠色熒光，重疊結(jié)果顯示紅色熒光在細(xì)胞表面，表明HCV結(jié)構(gòu)蛋白定位在細(xì)胞膜上。
　　 4、重組的桿狀病毒感染Sf9細(xì)胞72h后，選用一抗為小鼠抗Flag時Western-blot檢測顯示：vAc-FBD-F-C感染后的Sf9細(xì)胞在21kD處顯示有特異性條帶；vAc-FBD-F-E感染后的Sf9細(xì)胞在63kD處顯示有特異性條帶；vAc-FBD-F-CE感染后的Sf9細(xì)胞在84kD處顯示有特異性條帶。結(jié)果

8、證明能夠在重組病毒中檢測到HCV結(jié)構(gòu)蛋白的表達，說明HCV結(jié)構(gòu)蛋白能夠成功展示在重組病毒粒子表面。
　　 5、重組質(zhì)粒pET32a-FDSC經(jīng)EcoRⅠ/NotⅠ雙酶酶切，電泳顯示在650bp和5.9kb處呈現(xiàn)明顯條帶，表明pET32a-FDSC原核表達載體構(gòu)建成功。
　　 6、pET32a-FDSC誘導(dǎo)表達蛋白的SDS-PAGE電泳驗證結(jié)果表明用IPTG誘導(dǎo)蛋白表達后，SDS-PAGE電泳分析表達得到的蛋白大小約40.

9、3kD，結(jié)果與理論預(yù)測相符。
　　 7、pET32a-FDSC誘導(dǎo)表達蛋白條件的優(yōu)化，實驗結(jié)果表明在37℃用0.5mmol/LIPTG誘導(dǎo)4h能有效地誘導(dǎo)重組蛋白的表達。
　　 8、pET32a-FDSC誘導(dǎo)表達蛋白的純化及Western-blot鑒定結(jié)果顯示經(jīng)Ni-NTA親和層析柱純化獲得目的蛋白，Western-blot檢測表明純化獲得的目的蛋白能與特異性抗體相結(jié)合。
　　 結(jié)論：
　　 本實驗構(gòu)建了

10、含有HCVC，E和CE的重組桿狀病毒，Western-blot檢測結(jié)果顯示含有HCVC的重組桿狀病毒感染細(xì)胞后在21kD出現(xiàn)特異性條帶；含有HCVE的重組桿狀病毒感染細(xì)胞后在63kD出現(xiàn)特異性條帶；含有HCVCE融合片段的重組桿狀病毒感染細(xì)胞后在84kD出現(xiàn)特異性條帶，表明這些重組病毒構(gòu)建成功，并能夠成功地將HCV結(jié)構(gòu)蛋白展示在重組病毒粒子表面。同時用免疫熒光對重組病毒感染的細(xì)胞進行檢測，結(jié)果表明HCV結(jié)構(gòu)蛋白定位在細(xì)胞膜上。說明HCV