Bac-to-Bac桿狀病毒昆蟲表達(dá)系統(tǒng)介導(dǎo)重組腺相關(guān)病毒的制備.pdf

1、目的：通過桿狀病毒昆蟲表達(dá)系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)臨床級重組腺相關(guān)病毒(rAAV)的制備。
　　 方法：將腺相關(guān)病毒(AAV)載體pAAV-MCS的兩端反向重復(fù)序列(ITR)及目的基因表達(dá)框用限制性內(nèi)切酶PciI和SfoI雙酶切，得到大小約2053bp的目的片段，過膠純化回收后用Klenow平端化處理。桿狀病毒載體pFastBacDual用限制性內(nèi)切酶KpnI和HindⅢ雙酶切，過膠純化回收得到4806bp的目的片段，通過Klenow和T4P

2、olymerase平端化處理，用SolutionⅠ連接酶將兩個(gè)片段連接到一起，構(gòu)建成6859bp大小的順式載體。經(jīng)NdeI和HpaI雙酶切和EcoRI單酶切鑒定，及DNA測序無誤后命名為pBclAAV-MCS；為了檢測兩桿狀病毒昆蟲表達(dá)系統(tǒng)的可行性，設(shè)計(jì)正向引物EGFP-EcoRI-F和反向引物EGFP-Xbal-R經(jīng)PCR反應(yīng)從pIRES-EGFPk中增得到大小約720bp的EGFP基因片段，因?yàn)閜BclAAV-MCS有同樣的酶切位點(diǎn)

3、EcoRI和XbaI，用SolutionⅠ連接酶將EGFP基因片段插入到pBclAAV-MCS的EcoRI和XbaI位點(diǎn)，經(jīng)DNA測序正確后命名為pBclAAV-EGFP。反式載體是利用真核細(xì)胞基因表達(dá)調(diào)控的遺漏掃描(leaky scanning)原理，在幾個(gè)翻譯起始部位引入ACG或CTG，這樣一個(gè)啟動子可以同時(shí)啟動表達(dá)多個(gè)片段，將pAAV-MCS的衣殼蛋白(Capl)和復(fù)制蛋白(Rep2)經(jīng)PCR反應(yīng)分別克隆至桿狀病毒表達(dá)載體pFas

4、tBacDual的啟動子PP10和PPH下，命名為pBclAAVCap/Rep。分別將順式載體和反式載體轉(zhuǎn)化到DH10BacTM感受態(tài)中，制備成重組桿狀病毒顆粒Bacmid，經(jīng)PCR鑒定正確后，分別命名為Bacmid AAV-EGFP和Bacmid AAV-Cap/Rep。按照Invitrogen質(zhì)粒提取步驟提取Bacmid DNA后分別用轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體CellfectinⅡ包裝，轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞制備P1病毒，然后用P1擴(kuò)增P2病毒，使病

5、毒滴度達(dá)到約1012v.g./ml，用Bacmid AAV-EGFP和Bacmid AAV-Cap/Rep的P2病毒共感染昆蟲細(xì)胞sf9完成rAAV的拯救和包裝過程。最后rAAV感染293T細(xì)胞來檢測其活性。
　　 結(jié)果：順式載體由pAAV-MCS和pFastBacDual剪接嵌合而成，大小為6859bp，酶切鑒定及測序正確，命名為pBclAAV-MCS，將EGFP引入其多克隆位點(diǎn)，來檢測該系統(tǒng)的可行性，測序正確后命名為pBcl

6、AAV-EGFP；反式載體是利用真核基因遺漏掃描原理表達(dá)AAV的包裝元件，其中衣殼蛋白是南同一mRNA、不同起始密碼子和共同的終止子轉(zhuǎn)錄生產(chǎn)，復(fù)制蛋白包含Rep78和Rep52，起始密碼子分別是AUG和CUG，將衣殼蛋白和復(fù)制蛋白這兩個(gè)基因表達(dá)片段經(jīng)PCR反應(yīng)連接到相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，分別克隆到桿狀病毒載體pFastBacDual的啟動子PP1O下的KpnI和XhoI位點(diǎn)和PPH下的HindⅢ和BamHI位點(diǎn)，經(jīng)DNA測序正確后命名

7、為pBclAAVCap/Rep。此后將順式載體和反式載體分別再轉(zhuǎn)化到DH10BacTM感受態(tài)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)座形成桿粒Bacmid、在懸浮培養(yǎng)的昆蟲sf9細(xì)胞中制備成桿狀病毒，病毒滴度可達(dá)1-3x1012v.g./ml。然后用二桿狀病毒共感染sf9細(xì)胞，完成rAAV-EGFP的拯救、復(fù)制和包裝過程，經(jīng)感染293T細(xì)胞測試具有良好的生物學(xué)活性。
　　 結(jié)論：該系統(tǒng)克服了常規(guī)rAAV制備的限制性因素，為臨床級基因治療用病毒的制備提供了實(shí)驗(yàn)