NH4Cl和細(xì)胞內(nèi)pH值對星形膠質(zhì)細(xì)胞作用的研究.pdf

1、前言：
　　肝性腦?。℉epatic encephalopathy，HE）是各種嚴(yán)重肝病所致的以代謝紊亂為基礎(chǔ)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失常綜合征，其主要臨床表現(xiàn)為性格改變、智力減退、意識障礙、行為失常和昏迷等。HE發(fā)病機制尚未完全闡明，有很多假說，其中氨中毒假說在HE的發(fā)病機制中占主要地位，降血氨是治療HE的有效措施之一。
　　HE的病理變化以星形膠質(zhì)細(xì)胞病變?yōu)橹?。星形膠質(zhì)細(xì)胞在膠質(zhì)細(xì)胞中數(shù)量最多，體積最大。其胞體呈星形，并向外伸

2、出放射狀突起伸展充填于神經(jīng)元之間，包裹神經(jīng)元的突觸區(qū)域，同時其終足又包繞毛細(xì)血管，腦內(nèi)毛細(xì)血管表面85％～99％被星形膠質(zhì)細(xì)胞的突起所覆蓋。因此星形膠質(zhì)細(xì)胞在腦能量代謝中發(fā)揮重要作用。
　　肝功能衰竭時，機體內(nèi)氨生成過多而肝臟對氨的清除能力降低，致使血氨濃度顯著增高，高濃度的血氨通過血腦屏障進入腦組織，引起腦功能障礙。因為與鳥氨酸循環(huán)有關(guān)的酶在腦內(nèi)不表達(dá)，所以腦中清除氨主要依靠谷氨酰胺合成這一途徑。谷氨酰氨合成酶（glutamin

3、e synthetase，GS）主要存在于星形膠質(zhì)細(xì)胞，因此星形膠質(zhì)細(xì)胞是腦中清除氨的主要細(xì)胞，是氨解毒的主要場所。
　　HE能影響大腦能量代謝。很多研究顯示，氨能刺激糖酵解，增加糖酵解代謝途徑中的酶，如磷酸果糖激酶、烯醇化酶、三磷酸甘油醛脫氫酶和丙酮酸激酶活性。但高氨條件下，這些酶活性增加是否與其mRNA及蛋白表達(dá)有關(guān)，目前還不清楚。
　　己糖激酶(hexokinase，HK)是糖酵解途徑的第一個限速酶，在哺乳動物組織中有

4、四種類型，即HKⅠ-Ⅳ。Ⅰ型:是葡萄糖依賴的組織如腦組織主要的同工酶。Ⅱ型:主要存在骨骼肌和其它胰島素敏感的組織。Ⅲ型:除豬紅細(xì)胞外，還沒有發(fā)現(xiàn)在其它組織占優(yōu)勢。Ⅳ型:又稱葡萄糖激酶，主要存在肝和胰腺β-細(xì)胞。
　　磷酸果糖激酶(Phosphofructokinase，PFK)是調(diào)節(jié)糖酵解過程的幾個限速酶中最重要的酶。在哺乳動物，PFK的活化型是由三個不同亞基任意結(jié)合形成同源或異源具有不同變構(gòu)效應(yīng)和催化特性的四聚體。這三個亞基類型

5、分別是PFK-A(musle)、PFK-B(liver)、PFK-C(brain)。
　　丙酮酸激酶(Pyruvate-kinase，PK)調(diào)節(jié)糖酵解流量的作用僅次于PFK，是糖酵解過程中最后一個限速酶，它催化磷酸烯醇式丙酮酸形成丙酮酸。在哺乳動物，PK由兩個平行基因（PKLR和PK-M）編碼，每個基因可被選擇性剪接，共形成四個PK亞型。L和R亞型來源于PKLR基因，由不同的啟動子控制，分別特異性表達(dá)在肝和紅細(xì)胞。PK-M基因包含

6、12個外顯子，9和10外顯子以一個相互排斥的方式被選擇性剪接，形成PK-M1和PK-M2亞型。PK-M1主要表達(dá)在分化成熟的組織和細(xì)胞，如肌肉、心臟和腦細(xì)胞，而PK-M2則表達(dá)在癌細(xì)胞以及胚胎和未分化的組織。
　　丙酮酸脫氫酶復(fù)合體(pyruvate dehydrogenase complex，PDHC)是一個線粒體多成分酶系，能不可逆地催化丙酮酸氧化脫羧形成乙酰CoA，在能量代謝調(diào)控過程中起著關(guān)鍵作用。哺乳動物PDHC由三個催化

7、蛋白組成，即丙酮酸脫氫酶(E1)、二氫硫辛酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(E2)、二氫硫辛酸脫氫酶(E3)。PDHC其它的蛋白還包括兩個調(diào)節(jié)蛋白和一個功能未知的蛋白X。PDH E1是焦磷酸硫胺素依賴性的酶，催化丙酮酸開始脫羧。它是一個四聚體，由兩個相同的α亞基和兩個相同的β亞基組成。α亞基又分為α1和α2兩種亞型，α1是編碼體細(xì)胞的亞型，位于X染色體，α2無內(nèi)含子，只表達(dá)在生精細(xì)胞，位于常染色體。
　　丙酮酸羧化酶（pyruvate carboxy

8、lase，PC）存在于線粒體中。在腦內(nèi)，PC特異性表達(dá)在星形膠質(zhì)細(xì)胞，能不可逆地催化丙酮酸形成草酰乙酸，在三羧酸循環(huán)中，這是供給草酰乙酸的主要補充反應(yīng)。PC是核編碼的線粒體酶，是由4個相同的亞基組成的同源四聚體。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，PC與谷氨酸、γ-氨基丁酸等神經(jīng)遞質(zhì)庫的補給有關(guān)。
　　方法：
　　采用原代培養(yǎng)的小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞、小腦顆粒神經(jīng)元以及皮層神經(jīng)元，分別用NH4Cl處理2h-5d，用RT-PCR和免疫印跡方法檢測NH4

9、Cl對葡萄糖轉(zhuǎn)運體1(GLUT1)及糖酵解時一些關(guān)鍵酶如己糖激酶1(HK1)、丙酮酸激酶-M亞型(PK-M)、磷酸果糖激酶-A(PFK-A)、丙酮酸脫氫酶E1α1亞單位(PDH-α1)、丙酮酸羧化酶(PC)的mRNA和蛋白表達(dá)變化。使用SPSS12.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，多組資料用one-way ANOVA方法進行比較，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1、NH4Cl對星形膠質(zhì)細(xì)胞乳酸生成的影響
　

10、　1mM、3mM、5mM NH4Cl處理星形膠質(zhì)細(xì)胞4h-3d，各劑量組都可引起乳酸生成增加。NH4Cl處理2h和5d時，對星形膠質(zhì)細(xì)胞乳酸生成基本無影響。
　　2、在NH4Cl作用下，GLUT1、HK1、PK-M、PFK-A、PDH-α1、PC mRNA在星形膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)。
　　NH4Cl對星形膠質(zhì)細(xì)胞糖酵解關(guān)鍵酶mRNA作用的濃度曲線和時間曲線顯示，1mM、3mM、5mM NH4Cl處理星形膠質(zhì)細(xì)胞2天，PK-M、PF

11、K-A mRNA表達(dá)增加，在3mM、5mM NH4Cl作用下，PDH-α1 mRNA表達(dá)增加。3mM NH4Cl處理星形膠質(zhì)細(xì)胞，1-5 d時間段，PK-M mRNA表達(dá)增加，12h-5d時間段，PFK-A、PDH-α1mRNA表達(dá)增加。不同濃度NH4Cl處理星形膠質(zhì)細(xì)胞，在不同時間段，GLUT1、HK1、PC mRNA表達(dá)無變化。
　　3、小鼠腹腔注射尿素酶，大腦PK-M、PFK-A、PDH-α1mRNA的表達(dá)
　　小鼠腹

12、腔注射尿素酶4d，大腦PK-M、PFK-A、PDH-α1mRNA表達(dá)開始增加，PK-M、PFK-A持續(xù)到第7d，PDH-α1持續(xù)到第8天。在1-3d時間段，大腦PK-M、 PFK-A、PDH-α1 mRNA表達(dá)無變化。
　　4、在NH4Cl作用下，星形膠質(zhì)細(xì)胞PK-M、PFK-A、PDH-α蛋白表達(dá)
　　3mMNH4Cl處理星形膠質(zhì)細(xì)胞2d，PK-M、PFK-A、PDH-α1蛋白表達(dá)增加。
　　5、在NH4Cl作用下，

13、小腦顆粒神經(jīng)元和皮層神經(jīng)元PK-M、PFK-A、PDH-α1 mRNA的表達(dá)
　　3mMNH4Cl處理小腦顆粒神經(jīng)元3d，PDH-α1 mRNA表達(dá)增加，PK-M、PFK-AmRNA表達(dá)無變化。3 mM NH4Cl處理皮層神經(jīng)元2d和3d時，PK-M、PFK-AmRNA表達(dá)增加，在1-3 d不同時間段，PDH-α1 mRNA表達(dá)無變化。
　　6、在NH4Cl作用下，小腦顆粒神經(jīng)元和皮層神經(jīng)元PK-M、PFK-A、PDH-α1

14、蛋白的表達(dá)
　　3mMNH4Cl處理小腦顆粒神經(jīng)元3天，PK-M、PFK-A、PDH-α1蛋白表達(dá)無變化。3mMNH4Cl處理皮層神經(jīng)元3天，PFK-A蛋白表達(dá)增加，PK-M、PDH-α1蛋白表達(dá)無變化。
　　討論：
　　葡萄糖跨膜轉(zhuǎn)運是依賴葡萄糖轉(zhuǎn)運體(glucose transport，GLUT)來實現(xiàn)的，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)5種葡萄糖轉(zhuǎn)運體(GLUT1-5)，它們分別在不同的組織細(xì)胞中起作用。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，血管內(nèi)皮細(xì)胞和星

15、形膠質(zhì)細(xì)胞主要表達(dá)GLUT1。GLUT1表達(dá)受多種因素調(diào)控。我們用NHaCl處理原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞，沒有發(fā)現(xiàn)GLUT1 mRNA表達(dá)發(fā)生變化。
　　很多研究顯示，氨能刺激糖酵解，增加糖酵解代謝途徑中的酶，如磷酸果糖激酶、烯醇化酶、三磷酸甘油醛脫氫酶和丙酮酸激酶活性。但本課題首次從mRNA和蛋白表達(dá)水平證明，氨確實能增強糖酵解代謝。在NH4Cl作用下，星形膠質(zhì)細(xì)胞糖酵解限速酶PK-M、PFK-A mRNA和蛋白表達(dá)增加，HK1

16、mRNA表達(dá)無變化;在腹腔注射尿素酶的小鼠腦中，PK-M、PFK-A mRNA表達(dá)也增加。這些結(jié)果和Ratnakumari和Murthy在整體腦研究發(fā)現(xiàn)相一致，他們用醋酸氨處理大鼠，觀察到大腦皮層、小腦和腦干糖酵解限速酶PK、PFK活性增加，HK活性沒有變化。同時我們也發(fā)現(xiàn)，在NH4Cl作用下，星形膠質(zhì)細(xì)胞乳酸生成增加，在PK-M、PFK-A mRNA表達(dá)沒有變化之前，乳酸生成增加就已經(jīng)開始。
　　星形膠質(zhì)細(xì)胞由于其特殊的超微結(jié)構(gòu)

17、，使其在腦能量代謝中發(fā)揮重要作用。在原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞，氨能明顯增加乳酸生成，降低丙酮酸/乳酸比率，但在神經(jīng)元，氨卻沒有作用。我們的實驗結(jié)果也顯示，在NH4Cl作用下，除皮層申經(jīng)元PFK-A mRNA和蛋白表達(dá)增加外，小腦顆粒神經(jīng)元PK-M、PFK-A mRNA和蛋白表達(dá)無變化。
　　在原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞，通過測量來自[1-14C] pyruvate的14CO2形成，發(fā)現(xiàn)氨能抑制丙酮酸脫羧。這是因為氨能阻礙蘋果酸-天冬氨酸

18、穿梭，降低線粒體草酰乙酸的利用率，影響TCA循環(huán)運行。由于草酰乙酸缺乏，導(dǎo)致乙酰CoA蓄積，乙酰CoA可抑制丙酮酸脫羧。在神經(jīng)元，氨對丙酮酸脫羧沒有作用。在實驗中我們也發(fā)現(xiàn)，在NH4Cl作用下，星形膠質(zhì)細(xì)胞PDH-α1 mRNA和蛋白表達(dá)增加，在腹腔注射尿素酶的小鼠腦中，PDH-α1 mRNA表達(dá)也增加。在皮層神經(jīng)元和小腦顆粒神經(jīng)元，PDH-α1蛋白表達(dá)卻沒有變化。
　　在高氨血癥動物腦中，丙酮酸羧化作用增強。用氨處理星形膠質(zhì)細(xì)胞

19、，也發(fā)現(xiàn)PC介導(dǎo)的流量增加，即谷氨酰胺濃度增加，這是因為谷氨酸合成與PC活性有關(guān)，而谷氨酸是谷氨酰胺的前體物質(zhì)。在實驗中，我們用NH4CI處理星形膠質(zhì)細(xì)胞，沒有發(fā)現(xiàn)PC mRNA表達(dá)發(fā)生變化。
　　結(jié)論：
　　在原代培養(yǎng)的小鼠大腦星形膠質(zhì)細(xì)胞，NH4Cl能增加PK-M、PFK-A、PDH-α1mRNA和蛋白表達(dá)。
　　前言：
　　鋰鹽治療雙相情感障礙最主要的機制是“肌醇消耗”假說。最初認(rèn)為低濃度鋰鹽通過對肌醇單磷

20、酸酶（inositol monophosphatase，IMPase）和肌醇多磷酸-1-磷酸酶(inositol polyphosphate(l)-phosphatase，IPPase)的非競爭性抑制作用，使參與磷酯酶C(phospholipase C，PLC)信號傳導(dǎo)的肌醇再生減少。此后研究發(fā)現(xiàn)鋰鹽介導(dǎo)肌醇消耗的另一個機制:鋰鹽慢性作用可抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞對肌醇的攝取。由于腦內(nèi)只有內(nèi)皮細(xì)胞可以合成肌醇，神經(jīng)元或膠質(zhì)細(xì)胞從細(xì)胞外攝取肌醇以

21、維持細(xì)胞內(nèi)肌醇水平就顯得尤為重要。
　　“肌醇消耗”假說不能完全解釋鋰鹽對雙相情感障礙躁狂相和抑郁相均有效的現(xiàn)象。一些研究發(fā)現(xiàn)，在肌醇水平較高時鋰鹽才可抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞對肌醇的攝取;而肌醇濃度低時，鋰鹽的慢性處理可引起細(xì)胞對肌醇的攝取增加。這可能與星形膠質(zhì)細(xì)胞攝取肌醇的過程中有兩個肌醇攝取載體參與有關(guān):高親合力的Na+-依賴性肌醇轉(zhuǎn)運體（Na+-dependent inositol transporter, SMIT）和低親

22、合力的H+-依賴性肌醇轉(zhuǎn)運體(H+-dependent inositol transporter, HMIT)。SMIT在pH較高時活性增加，而HMIT則在pH增加時活性降低。根據(jù)SMIT和HMIT在不同PH值條件下活性的變化，我們推測肌醇攝取的雙向調(diào)節(jié)可能為藥物治療躁狂抑郁雙相情感障礙的作用機理。
　　在本研究中，我們將觀察在細(xì)胞外液不同pH值和不同的肌醇濃度時，對星形膠質(zhì)細(xì)胞肌醇攝取的影響以及對細(xì)胞穩(wěn)態(tài)pHi的影響，證明細(xì)胞內(nèi)

23、pHi不同和細(xì)胞外液肌醇濃度不同，是否會對肌醇攝取產(chǎn)生影響，進一步闡明鋰鹽治療雙向情感障礙的作用機制。
　　方法：
　　采用原代培養(yǎng)的小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞，用不同濃度NH4Cl或不同pH值的培養(yǎng)液處理1小時，用5μM BCECF-AM進行熒光負(fù)載，以進行星形膠質(zhì)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)pHi的檢測。或者把[3H]inositol加到培養(yǎng)液中(0.5μCi/ml)，孵育細(xì)胞1小時后，進行液閃計數(shù)和蛋白測定。采用one-way ANOVA方法進行多

24、組間結(jié)果比較。P＜0.05表示具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1、細(xì)胞外液不同pH值和不同濃度NH4Cl對星形膠質(zhì)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)pHi的影響
　　原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)成熟后，放在pH值分別為6.0、6.5、7.4和8.0的培養(yǎng)液中，BCECF熒光負(fù)載孵育細(xì)胞1小時，測得的細(xì)胞內(nèi)pH值分別為6.37、6.78、7.11、7.38。可見，pHi隨著pHo的變化而變化，但由于細(xì)胞pHi的調(diào)節(jié)功能，pHi的變化幅度顯著低于p

25、Ho的變化幅度。用0，2.5 mM，5 mM，7.5 mM和10mM NH4Cl處理星形膠質(zhì)細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)pHi分別是7.12，6.85，6.75，6.76和6.72，說明NH4Cl在星形膠質(zhì)細(xì)胞引起濃度依賴性細(xì)胞酸化。
　　2、細(xì)胞外液pH值與肌醇濃度對肌醇攝取的影響
　　培養(yǎng)液肌醇濃度100μM時，細(xì)胞肌醇攝取率在pH6.5(510 pmol/mg/min)明顯高于pH8.0（416 pmol/mg/min），說明在高濃度

26、肌醇時，細(xì)胞酸化顯著增加肌醇攝取。
　　3、培養(yǎng)液中含有不同濃度的NH4Cl時，對星形膠質(zhì)細(xì)胞攝取肌醇的影響
　　在中(25μM)、低(10μM)濃度肌醇時，NH4Cl引起的細(xì)胞內(nèi)酸性化顯著降低肌醇的攝取。
　　4、SMIT抑制劑phloridzin(PZ，50μM)對星形膠質(zhì)細(xì)胞肌醇攝取的影響
　　在低濃度(10μM)肌醇情況下，細(xì)胞內(nèi)酸性化顯著降低肌醇攝取，使用低濃度PZ抑制SMIT后，肌醇攝取率則無明顯差異

27、，顯示HMIT不參與上述變化。
　　5、高濃度PZ(3 mM)對星形膠質(zhì)細(xì)胞攝取肌醇的影響
　　高濃度PZ(3 mM)抑制SMIT和HMIT，此時肌醇攝取為被動擴散，此實驗證實肌醇的被動擴散速度很低，并且呈濃度依賴性。
　　討論：
　　本課題通過測定1小時[3H]myo-inositol的積累做為肌醇攝取率，來研究細(xì)胞外液不同肌醇濃度及不同的細(xì)胞內(nèi)pHi時，原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞對肌醇的攝取作用。
　　我們

28、用pH為6.5、7.4、8.0的培養(yǎng)液孵育星形膠質(zhì)細(xì)胞1小時，測得的細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)pHi分別為6.78、7.11、7.38。盡管培養(yǎng)液pH已達(dá)8.0，但由于星形膠質(zhì)細(xì)胞自身的pHi調(diào)節(jié)功能，細(xì)胞并沒有被相應(yīng)的堿化。在培養(yǎng)液肌醇濃度10μM，pH分別為6.5、8.0、7.4時，各組間星形膠質(zhì)細(xì)胞肌醇攝取率變化不大，但隨著肌醇濃度加大，肌醇攝取率在pH6.5時高于pH8.0，尤其在培養(yǎng)液肌醇濃度100μM時，這種差距明顯加大。這說明，在細(xì)胞酸化

29、時，隨著肌醇濃度加大，低親和力的HMIT活性增強，對肌醇的攝取增加。
　　我們用pH為6.0的培養(yǎng)液孵育星形膠質(zhì)細(xì)胞1小時，測得的細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)pHi分別為6.37。在培養(yǎng)液肌醇濃度10μM時，肌醇攝取率在pH6.0時明顯低于pH7.4，這個結(jié)果表明，在細(xì)胞酸化，細(xì)胞外肌醇處于低水平時，高親和力的SMIT肌醇攝取活性降低，對肌醇的攝取減少，用不同濃度的NH4Cl處理1小時，能引起星形膠質(zhì)細(xì)胞酸化，也可得到相似的結(jié)果。用競爭性Na+-依

30、賴性肌醇轉(zhuǎn)運抑制劑PZ（50μM）抑制SMIT，在pH7.4和6.0時的肌醇攝取率都明顯下降，并且都降到幾乎相等的水平。這是由于PZ抑制了SMIT，此時的肌醇肌醇攝取率代表的是HMIT，HMIT和肌醇親和力低，雖然它在酸性條件下活性增加，但在細(xì)胞外肌醇處于低水平時，限制了其攝取肌醇作用的發(fā)揮。
　　用高濃度PZ(3 mM)抑制SMIT和HMIT后，此時的肌醇攝取率應(yīng)該代表的是細(xì)胞外肌醇自由彌散到細(xì)胞內(nèi)的肌醇量。由于量較少，約為肌醇

31、攝取的2％，在本課題中，忽略不計。
　　“鋰鹽治療雙相情感障礙最主要的機制是“肌醇消耗”假說，但該假說不能解釋鋰鹽在臨床上對雙向情感障礙患者躁狂期和抑郁期都有效這一現(xiàn)象。因此我們提出“鋰鹽慢性處理可使星形膠質(zhì)細(xì)胞堿化，從而雙向性調(diào)節(jié)細(xì)胞對肌醇的攝取，以維持細(xì)胞內(nèi)肌醇含量的恒定和IP3信號系統(tǒng)的正常功能”的假說。本課題的實驗結(jié)果支持這個假說，為這個假說的進一步完善提供了實驗和理論依據(jù)，也進一步闡明了鋰鹽治療雙向情感障礙的作用機制。<