不同藥物對(duì)NH4Cl誘導(dǎo)的肝細(xì)胞模型能量代謝影響.pdf

1、背景：
　　肝臟是人體葡萄糖、脂類(lèi)、蛋白質(zhì)、維生素和激素等物質(zhì)代謝的重要器官，在人體生物轉(zhuǎn)化、解毒、代謝、消化、分泌、排泄和免疫過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。當(dāng)肝臟功能受損，“殘存”的肝細(xì)胞不能滿(mǎn)足機(jī)體代謝需要時(shí)，導(dǎo)致機(jī)體代謝紊亂，例如乳酸中毒、血氨及吲哚水平升高等。慢加急性肝衰竭（ACLF）指在慢性肝臟疾病情況下，肝臟功能在短期（2-4周）內(nèi)出現(xiàn)嚴(yán)重受損，喪失其合成及解毒功能，從而導(dǎo)致黃疸、肝性腦病、凝血功能障礙和繼發(fā)多器官功能衰竭

2、的一組臨床癥候群[1]。其發(fā)病急，病情重，治療難度大，死亡率高[2]。目前認(rèn)為血氨增高與慢加急性肝衰竭最主要的并發(fā)癥--肝性腦病的發(fā)生密切相關(guān)[3]。
　　血氨由機(jī)體組織中各種氨基酸分解代謝產(chǎn)生的氨以及由腸管吸收進(jìn)來(lái)的氨進(jìn)入血液而形成，目前認(rèn)為血氨主要在肝臟經(jīng)鳥(niǎo)氨酸循環(huán)代謝成無(wú)毒的尿素排出體外[4]。慢加急性肝衰竭時(shí)，肝臟將氨合成為尿素的能力減退，引起血氨增高。升高的血氨可引起腦星形膠質(zhì)細(xì)胞腫脹、神經(jīng)遞質(zhì)合成及釋放障礙、增加氧化應(yīng)

3、激等，增加肝性腦病、腦水腫、腦疝、癲癇等疾病的發(fā)生率，從而影響患者預(yù)后[5]。由于動(dòng)脈血氨水平升高，肝衰竭患者會(huì)發(fā)生大腦能量代謝紊亂，包括糖酵解、三羧酸循環(huán)及氧化呼吸電子鏈等過(guò)程，從而導(dǎo)致能量缺失。Bhatia等的研究表明，動(dòng)脈血氨濃度>124umol/L與重型肝性腦病和腦水腫的發(fā)生有關(guān)[6]。一般認(rèn)為血氨升高僅僅與肝性腦病相關(guān)，尚無(wú)證據(jù)表明血氨能對(duì)肝細(xì)胞產(chǎn)生直接或間接影響，但本課題組的研究表明，血氨對(duì)肝細(xì)胞產(chǎn)生的影響遠(yuǎn)比我們想象的多。

4、
　　眾所周知，在慢加急性肝衰竭中，大量肝細(xì)胞壞死，殘存的肝細(xì)胞功能維持是非肝移植患者生存和救治的希望，因此如何更好維護(hù)“殘存”肝細(xì)胞的功能，改善肝細(xì)胞能量供應(yīng)、減輕線(xiàn)粒體損傷，也是目前肝衰竭支持治療重要的研究課題。我們前期研究的結(jié)果提示：肝衰竭引起的血氨升高不單單會(huì)引起“肝性腦病”，還會(huì)造成肝細(xì)胞以凋亡形式為主的損傷，抑制肝細(xì)胞的再生。臨床回顧性研究發(fā)現(xiàn)：早期、全程應(yīng)用降血氨藥物能夠顯著緩解患者肝臟損傷、降低患者死亡率、改善患者

5、預(yù)后[7]。既往研究大多集中于氨對(duì)大腦細(xì)胞能量代謝的影響，而氨對(duì)肝細(xì)胞能量代謝的影響尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)高氨細(xì)胞模型的建立，揭示氨在肝細(xì)胞能量代謝過(guò)程中的作用，同時(shí)對(duì)比左卡尼汀、復(fù)方二氯醋酸二異丙胺、曲美他嗪對(duì)高氨誘導(dǎo)的肝細(xì)胞能量代謝影響。
　　目的：
　　1.建立高氨肝細(xì)胞模型，檢驗(yàn)氯化銨是否對(duì)肝細(xì)胞產(chǎn)生毒性
　　2.應(yīng)用濃度梯度的氯化銨處理培養(yǎng)的人正常肝細(xì)胞 chang liver細(xì)胞，檢測(cè)糖酵解及三羧酸循環(huán)過(guò)程中

6、化合物、酶的水平的變化，從而闡述氨對(duì)肝細(xì)胞的能量代謝影響
　　3.用左卡尼汀、復(fù)方二氯醋酸二異丙胺、曲美他嗪對(duì)高氨處理的肝細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，檢測(cè)肝細(xì)胞生長(zhǎng)狀況及細(xì)胞內(nèi)乳酸的變化。
　　方法：
　　氨中毒的細(xì)胞模型
　　1.CCK-8法檢測(cè)氨及三種藥物對(duì)肝細(xì)胞的毒性作用
　　2.ELISA法及生化自動(dòng)分析儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)糖酵解及三羧酸循環(huán)過(guò)程中乳酸、丙酮酸、丙酮酸激酶、乳酸脫氫酶、丙酮酸脫氫酶、乙酰COA的變化水平<

7、br>　　結(jié)果
　　隨氯化銨濃度的升高及作用時(shí)間的延長(zhǎng)，氯化銨對(duì) chang liver細(xì)胞的抑制率逐漸增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；隨氯化銨濃度的增加，細(xì)胞內(nèi)丙酮酸、丙酮酸激酶、乳酸脫氫酶含量升高，而丙酮酸脫氫酶、乙酰 COA的表達(dá)量降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；氯化銨可以引起細(xì)胞內(nèi)乳酸升高，其中以5mM NH4Cl引起乳酸濃度最高；用5mM NH4Cl及左卡尼汀、復(fù)方二氯醋酸二異丙胺、曲美他嗪處理人肝細(xì)

8、胞 Chang liver,左卡尼汀、復(fù)方二氯醋酸二異丙胺聯(lián)合處理組細(xì)胞增殖情況較氯化銨處理組升高（P<0.05)，而曲美他嗪不能改善氯化銨引起的肝細(xì)胞生長(zhǎng)抑制現(xiàn)象；此外，左卡尼汀聯(lián)合處理組及復(fù)方二氯醋酸二異丙胺聯(lián)合處理組乳酸水平較氯化銨單獨(dú)處理組降低（P<0.05),其中左卡尼汀效果較好；而曲美他嗪聯(lián)合處理組則升高（P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.氯化銨對(duì)肝細(xì)胞生長(zhǎng)具有抑制作用，且隨濃度升高，抑制率增加。