肝素對星形膠質細胞的活化作用及其機制研究.pdf

1、在中樞神經系統(tǒng)中，星形膠質細胞主要對神經元起支持作用。當中樞神經系統(tǒng)發(fā)生損傷，如外傷、局部缺血和缺氧等，星形膠質細胞會由靜息態(tài)進入活化態(tài)，即發(fā)生星形化，從而參與突觸形成和神經可塑性的調節(jié)。在急性損傷期，活化的星形膠質細胞發(fā)揮著重要的作用，它不但能夠提供營養(yǎng)因子，促進神經再生，還能將損傷區(qū)與正常組織進行隔離，防止損傷面積的擴大。但是，當損傷進入慢性期，以活化星形膠質細胞等為主要成分的膠質瘢痕會成為神經再生的機械性屏障，不利于神經損傷的修復

2、。因此，星形膠質細胞活化的具體機制成為神經損傷修復治療中的一個關鍵內容。
　　 肝素，是星形膠質細胞發(fā)生活化時分泌量出現(xiàn)增長的細胞外基質之一，本研究利用肝素的這一性質，將其作用于大鼠原代星形膠質細胞，從形態(tài)、增殖和遷移的角度證實肝素誘導星形膠質細胞活化的性質，制備能夠模擬體內活化且程度可控的體外模型，并進一步探究誘導星形膠質細胞發(fā)生活化的內在分子機制，為神經損傷治療的有效進行提供實驗依據(jù)。本文的主要內容如下:
　　 1、

3、原代星形膠質細胞的培養(yǎng)及純化。以經典的McCarthy法為基礎，取新生大鼠的大腦皮層，消化后得到星形膠質細胞懸液，培養(yǎng)10天后通過搖床過夜振搖的方法去除生長在星形膠質細胞上層的少突膠質細胞和小膠質細胞。為了提高星形膠質細胞的純度，我們在接種細胞時采取差速黏附的方法減少成纖維細胞的污染，經過免疫熒光染色鑒定，培養(yǎng)細胞的GFAP陽性率從80％上升至95％以上，滿足了后續(xù)實驗對細胞純度的要求。
　　 2、肝素對星形膠質細胞活化作用的研

4、究。首先，通過伊紅染色和GFAP免疫熒光染色的方法檢測星形膠質細胞的形態(tài)變化。結果顯示肝素聯(lián)合FGF-2以劑量依賴的方式促進細胞骨架發(fā)生重組，細胞由多角形的靜息態(tài)向星形的活化態(tài)轉變;隨后的WesternBlotting結果顯示，肝素可以提高星形膠質細胞中GFAP的表達量，進而證實肝素聯(lián)合FGF-2能夠誘導星形膠質細胞發(fā)生活化。然后，通過BrdU摻入法和流式細胞術檢測星形膠質細胞的增殖情況，結果顯示肝素聯(lián)合FGF-2以劑量依賴的方式增加發(fā)

5、生DNA復制的細胞比例，而且能夠促進細胞由G1期向S期的轉變，提高細胞的增殖率。最后，通過Transwell小室法檢測星形膠質細胞的遷移情況，結果顯示肝素聯(lián)合FGF-2提高了星形膠質細胞的遷移能力。
　　 3、星形膠質細胞活化的機制研究。通過抑制劑篩選、WesternBlotting和PCR等方法檢測參與調控星形膠質細胞活化的信號通路，結果顯示MAPK中的ERK和PI3K/Akt信號通路以及細胞膜上的N-鈣粘素參與了肝素對星形膠