抗單、雙相抑郁癥藥物對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞作用的研究.pdf

1、單相和雙相抑郁癥均是常見的精神疾病，其中單相抑郁癥就是通常所說的抑郁癥，而雙相抑郁癥又稱為躁狂抑郁癥。目前臨床上，治療單相抑郁癥的主要藥物是以氟西汀為代表的五羥色胺特異性再攝取抑制劑(SSRIs)，治療雙相抑郁癥的藥物主要有碳酸鋰、丙戊酸鈉和卡馬西平三種。但是，這些藥物的確切藥理機(jī)制還都有待進(jìn)一步研究。 磷脂酶A2功能學(xué)上主要分為三類：分泌型磷脂酶A2(sPLA2)，非鈣離子依賴型磷脂酶A2(iPLA2)，細(xì)胞溶質(zhì)型磷脂酶A2(

2、cPLA2)。它們能水解細(xì)胞膜磷脂中sn—2位點(diǎn)的酰酯鍵，產(chǎn)生溶血磷脂和游離的脂肪酸(例如花生四烯酸)。其中，cPLA2的活化和花生四烯酸的釋放，通過不同機(jī)制分別與多巴胺、谷氨酸、五羥色胺等受體發(fā)生聯(lián)系，而這些作用又與第二信使水平的調(diào)控有關(guān)。cPLA2a亞型是cPLA2在星形膠質(zhì)細(xì)胞中的主要表達(dá)類型。在整體實(shí)驗(yàn)中，以臨床治療相關(guān)濃度分別喂食大鼠鋰鹽、卡馬西平六周或者丙戊酸30天后，每種藥物都可以減少體內(nèi)甘油磷脂脫酰基轉(zhuǎn)變?yōu)榛ㄉ南┧岬倪^

3、程，進(jìn)而影響隨后的再?；M(jìn)程。鋰鹽或卡馬西平慢性處理六周可以減少大鼠腦內(nèi)cPLA2a的表達(dá)。 五羥色胺(5—HT)是一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)，其受體有7種。5—HT2受體分為5—HT2A，5—HT2B和5—HT2C三種亞型，在原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞上均有表達(dá)。三種5—HT2受體均為Gq/11蛋白偶聯(lián)受體，它們能活化磷脂酶C(PLC)，后者可分解磷脂酰肌醇二磷酸(PIP2)產(chǎn)生二脂酰甘油(DAG)和三磷酸肌醇(IP3)，此反應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)

4、游離鈣離子濃度增加。在星形膠質(zhì)細(xì)胞中，氟西汀可通過5—HT2受體增加細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度。 研究表明細(xì)胞外信號(hào)調(diào)控激酶(ERK)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，例如在突觸可塑性和記憶形成等方面起到關(guān)鍵作用。據(jù)報(bào)道在星形膠質(zhì)細(xì)胞中，氟西汀刺激ERK1/2磷酸化，從而誘導(dǎo)基因表達(dá)。Fos蛋白家族是一組轉(zhuǎn)錄因子，包括c—Fos、FosB、Fra—1、Fra—2和delta—FosB(為FosB的剪接變體)。很多磷酸化的蛋白激酶可以影響Fos

5、蛋白表達(dá)，例如有絲分裂活化蛋白激酶(MAPK)、蛋白激酶A(PKA)、PKC。Fos蛋白可以影響蛋白穩(wěn)定性、蛋白結(jié)合活力、一些轉(zhuǎn)錄因子的間接激活潛力等。 原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞不含有五羥色胺轉(zhuǎn)載體。本課題主要在原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中，研究抗雙相抑郁癥藥物和氟西汀對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的作用及機(jī)制。即：①三種抗雙相抑郁癥藥物對(duì)PLA2的長期作用；②氟西汀是否通過5—HT2B受體引起ERK磷酸化，進(jìn)而影響轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)(以c—Fos和Fo

6、sB為檢測(cè)指標(biāo))。 方法： 采用原代培養(yǎng)的小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞。①分別用碳酸鋰、丙戊酸鈉、卡馬西平和托吡酯處理細(xì)胞1—4周，用RT-PCR和免疫印跡方法檢測(cè)藥物對(duì)PLA2三種亞型的作用；②在正?；蚪?jīng)5—HT2B受體siRNA干擾后的細(xì)胞中，氟西汀處理20分鐘觀察ERK1/2磷酸化水平，再用氟西汀處理正常細(xì)胞1或4小時(shí)后，觀察c—Fos和FosB mRNA或蛋白表達(dá)水平，并且檢測(cè)這一作用是否可被5—HT2B受體抑制劑SB204

7、741，或ERK1/2磷酸化抑制劑U0126所抑制。使用SPSS12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多組資料用one—way ANOVA方法進(jìn)行比較，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1、三種抗雙相抑郁癥藥物長期作用的酶特異性 藥物處理2周后，0.25 mM，0.5 mM和1 mM碳酸鋰，25μM和50μM卡馬西平，100μM和1 mM丙戊酸鈉均可使cPLA2a mRNA和蛋白表達(dá)發(fā)生上調(diào)，僅持續(xù)時(shí)間不同。但

8、是這三種藥物對(duì)sPLA2和iPLA2表達(dá)沒有影響。表明三種抗雙相抑郁癥藥物長期作用具有cPLA2a特異性。 2、三種抗雙相抑郁癥藥物對(duì)cPLA2a調(diào)節(jié)具有藥物特異性 與卡馬西平和丙戊酸鈉一樣，托吡酯也為抗癲癇藥物，但沒有抗雙相抑郁癥作用，100μM托吡酯對(duì)cPLA2a表達(dá)1—4周沒有作用。表明三種抗雙相抑郁癥藥物對(duì)cPLA2a長期作用具有抗雙相抑郁癥藥物特異性。 3、氟西汀通過5—HT2B受體引起ERK1/2磷酸

9、化 在正常培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中，10μM氟西汀20分鐘可以使ERK1/2磷酸化水平增高。但在5—HT2B受體成功沉默后的星形膠質(zhì)細(xì)胞中，氟西汀的這一作用消失。氟西汀的作用還可被蛋白激酶C(PKC)抑制劑GF109203X和鈣離子螯合劑所抑制。 4、氟西汀可增加c—Fos和FosB表達(dá) 10μM氟西汀在1小時(shí)和4小時(shí)分別增加c—Fos和FosB mRNA和蛋白表達(dá)水平。此作用可被SB204741和U0126抑制。表

10、明氟西汀是通過5—HT2B受體，引起ERK1/2磷酸化后，進(jìn)一步調(diào)節(jié)c—Fos和FosB表達(dá)。 討論： 1、三種抗雙相抑郁癥藥物對(duì)cPLA2a的調(diào)節(jié) 低濃度的碳酸鋰在研究時(shí)期內(nèi)僅對(duì)cPLA2a有上調(diào)作用，高濃度的碳酸鋰作用長時(shí)間后有下調(diào)作用。長期處理影響表達(dá)水平的理論還在卡馬西平和丙戊酸的結(jié)果中得到應(yīng)證，二者高濃度(50μM和1 mM)的作用在處理2—3周后達(dá)到峰值，在4周后上調(diào)幅度消除或者迅速下降，然而二者低濃

11、度(25μM和100μM)的作用在4周后更為顯著，且發(fā)展的更慢。相反的是，無抗雙相精神障礙療效的托吡酯沒有影響cPLA2a的表達(dá)，并且三種抗雙相精神障礙藥物對(duì)iPLA2和sPLA2 mRNA表達(dá)沒有改變。以上觀察(上調(diào)和下調(diào))均表明了酶的特異性和藥物的特異性，這些作用均有賴于藥物的濃度和處理時(shí)間。在本實(shí)驗(yàn)中所使用的藥物濃度與臨床藥物濃度具有相關(guān)性。 在本實(shí)驗(yàn)中，cPLA2a是PLA2中唯一對(duì)磷脂底物(可轉(zhuǎn)化為花生四烯酸)有特異作

12、用的。在星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)，花生四烯酸以復(fù)雜的方式干擾細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度。鈣離子在自身細(xì)胞內(nèi)，以及在星形膠質(zhì)細(xì)胞同神經(jīng)元之間均有信號(hào)傳導(dǎo)功能。并且，釋放的花生四烯酸能進(jìn)一步氧化為類花生酸類物質(zhì)，轉(zhuǎn)化為內(nèi)源性大麻素或者在細(xì)胞膜上再?；?，此過程在過去被大大低估了。 2、氟西汀對(duì)c—Fos和FosB的作用機(jī)制 RNA沉默實(shí)驗(yàn)表明，在分化后的星形膠質(zhì)細(xì)胞中氟西汀選擇性地作用于5—HT2B受體。氟西汀對(duì)ERK1/2的作用與以前報(bào)道

13、的氟西汀對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子的作用相似。在本實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)氟西汀對(duì)c—Fos和FosB表達(dá)的上調(diào)作用可以被U0126抑制，提示在星形膠質(zhì)細(xì)胞中氟西汀對(duì)基因的調(diào)控作用是由5—HT2B受體引起的ERK磷酸化所介導(dǎo)的。此作用是否為五羥色胺再攝取抑制劑(SSRIs)治療作用的關(guān)鍵，還有賴于檢驗(yàn)其它SSRIs藥物是否也刺激5—HT2B受體。氟西汀和帕羅西汀有相似的治療作用，近期實(shí)驗(yàn)我們還發(fā)現(xiàn)帕羅西汀誘導(dǎo)ERK磷酸化的濃度依賴性與氟西汀的作用完全一致。