外源性線粒體抗組織老化作用及機制研究.pdf

1、目的:1.通過檢測正常衰老的C57BL/6小鼠肺組織、氣道上皮細胞和人工下調(diào)細胞色素C氧化酶（COX）活性的C57BL/6小鼠肺組織、氣道上皮細胞的：線粒體DNA（mtDNA）突變率、COX活性、線粒體功能、活性氧水平、細胞功能，探索mtDNA突變率、COX活性、線粒體功能、活性氧與細胞老化之間的關系。
　　2.用外源性線粒體處理老年動物及老年細胞，檢測相關老化指標和功能指標，以確定外源性線粒體轉(zhuǎn)入細胞后是否發(fā)揮抗衰老作用。

2、>　　方法:1.從青年（1月齡）和老年（12月齡）C57BL/6小鼠肺組織提取青年線粒體（青Y mito）和老年（O mito）線粒體，純化后重懸于PBS以滴鼻方式處理青年和老年C57 BL/6小鼠，檢測指標：肺組織線粒體COX活性、肺組織線粒體DNA（mtDNA）突變率、肺組織激活型半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶-3（cleaved caspase-3）含量、肺組織丙二醛（MDA）含量、氣道纖毛擺動頻率（CBF）、肺組織線粒體懸液ATP

3、含量、肺組織線粒體呼吸控制率（RCR）。
　　2.從青年（1月齡）和老年（12月齡）C57BL/6小鼠肺組織提取青年線粒體和老年線粒體純化后，線粒體懸液加入細胞培養(yǎng)液共培養(yǎng)24小時后檢測指標：細胞線粒體COX活性、細胞纖毛擺動頻率（CBF）、線粒體懸液ATP含量、線粒體呼吸控制率（RCR）、NAD/NADH、鈣信號（[Ca2+]i）、ROS。
　　3.慢病毒感染C57 BL/6小鼠，下調(diào)COX蛋白表達，檢測COX活性和CBF

4、、ATP、RCR等功能指標；外源性線粒體處理后再檢測COX活性和CBF、ATP、RCR等功能指標。
　　4.在原代 C57 BL/6小鼠氣道上皮細胞中轉(zhuǎn)入COX干擾質(zhì)粒后，下調(diào)COX蛋白表達，檢測COX活性和CBF、ATP、RCR等功能指標，外源性線粒體處理后再檢測COX活性和CBF、ATP、RCR等功能指標。
　　結(jié)果:1.老年鼠肺組織mtDNA突變率、COX活性、Caspase-3含量、MDA含量明顯高于青年鼠，CBF、

5、ATP含量、RCR均低于青年鼠；以外源性線粒體處理后其突變率、Caspase-3含量、MDA含量均顯著下降，CFB、ATP含量、RCR均顯著提高。
　　2.老年細胞CBF于細胞長出后第6天開始下降，第9天降至最低值，持續(xù)至12天細胞開始死亡。于第9天加入外源性線粒體共培養(yǎng)，24小時后細胞CBF開始回升，直至第12天，細胞未死亡。相比青年細胞，老化細胞線粒體COX活性、ATP含量、RCR、NAD/N ADH均下降，細胞內(nèi)[Ca2+]

6、I含量、ROS水平上升；外源性線粒體共培養(yǎng)24小時后，ATP含量、RCR、NAD/N ADH顯著上升，細胞內(nèi)[Ca2+]I含量、ROS水平下降。
　　3.包被COX干擾質(zhì)粒的慢病毒感染后C57 BL/6小鼠肺組織線粒體COX活性、CBF、ATP、RCR等指標均顯著下降；之后用外源性線粒體處理，COX活性回升，CBF、ATP、RCR等指標也顯著回升。
　　4.轉(zhuǎn)入COX干擾質(zhì)粒后，原代C57 BL/6小鼠氣道上皮細胞線粒體CO

7、X活性和CBF、ATP、RCR等指標均顯著下降，胞漿[Ca2+]I含量、ROS水平上升；之后用外源性線粒體共培養(yǎng)，COX活性和CBF、ATP、RCR等指標顯著回升胞漿[Ca2+]I含量、ROS水平下降。
　　結(jié)論:1.老年動物及細胞ROS含量上升，線粒體mtDNA突變率增高導致mtDNA編碼的COX蛋白活性下降，直接影響線粒體呼吸功能，進而導致細胞各項功能下降、老化。
　　2.以外源性線粒體滴鼻處理C57BL/6小鼠，及外源