槐果堿抗實驗性大鼠肝纖維化作用及機制研究.pdf

1、研究背景及目的:肝纖維化是各種慢性肝病肝硬化發(fā)展的必經階段。病毒、乙醇、寄生蟲、銅鐵沉積、化學毒物、膽汁淤積以及營養(yǎng)不良等原因長期反復作用,導致慢性肝損傷,引發(fā)肝星狀細胞(HSC)激活、增殖和細胞外基質(ECM)特別是Ⅰ、Ⅲ膠原的過度合成而降解相對不足,使ECM在肝內過多沉積引起肝纖維化。轉化生長因子-β1(TGF-β1)介導的信號通路在HSC激活以及ECM的產生中起重要作用。 臨床上有效的抗肝纖維化藥物不多,秋水仙喊、糖皮質激

2、素、青霉胺等抗肝纖維化的藥物臨床療效不十分肯定,且嚴重副作用較多,從而限制了其在臨床的應用。中草藥及其單體抗肝纖維化的研究一直比較活躍,迄今為止,已經發(fā)現(xiàn)一些中草藥具有抗肝纖維化的作用,如苦參堿、丹參、柴胡等。 槐果堿是從中藥苦豆子中提取的一種苦參型生物堿。近年來,研究表明槐果堿有明顯抗柯薩奇B病毒(CVB)的作用及免疫調節(jié)功能。在體外100mg/L以上濃度時有明顯的抗SARS病毒的作用。此外,槐果堿具有抑制HepG2.2.15

3、細胞分泌HBsAg、HBeAg的作用,對HepG2.2.15細胞分泌HBeAg的抑制率明顯優(yōu)于拉米夫定。關于其是否具有抗肝纖維化作用未見報道。本研究主要探討槐果堿對大鼠肝纖維化模型纖維化進程的抑制作用及可能機制。 研究方法: 1、體內實驗：20mg/kg槐果堿干預二甲基亞硝胺(DMN)及膽總管結扎(BDL)致實驗性大鼠肝纖維化模型,三周后處死,檢測各組血清中丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)、總膽紅

4、素(TB)和直接膽紅素(DB);HE染色及Masson染色評估各組肝纖維化病理進程；堿水解法檢測肝組織中羥脯氨酸(HP)含量；免疫組化檢測α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)及I型膠原表達；RT-PCR檢測α-SMA、TGF-β1及Ⅰ型前膠原α1mRNA表達。 2、體外實驗：采用改良Fredimen法分離、培養(yǎng)大鼠HSC,抗desmin免疫細胞化學染色法鑒定HSC;RT-PCR檢測槐果堿干預大鼠原代培養(yǎng)HSCα-SMA、TGF-β1

5、及Ⅰ型前膠原α1mRNA表達,免疫熒光檢驗槐果堿干預后desmin及α-SMA表達；CellCounting Kit-8(CCK-8)及5-溴,2-脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)檢測槐果堿對活化大鼠HSC增殖的影響。 研究結果: 1、肝功能結果顯示DMN模型大鼠血清ALT、AST及TB水平明顯高于正常組大鼠,槐果堿干預后ALT、AST及TB明顯下降；BDL模型大鼠血清ALT、AST、TB及DB明顯高于正常組及假手術組,槐果堿

6、干預后ALT及AST明顯下降。 2、HE染色顯示槐果堿干預組與各模型組相比,肝纖維化程度明顯減輕。Masson染色顯示槐果堿干預組較各模型組纖維染色面積比明顯下降,槐果堿干預DMN組的纖維染色面積比為8.76％±0.73％,DMN模型組為19.73％±1.39％,兩組有顯著差異；槐果堿干預BDL組的纖維染色面積比為9.98％±0.71％,BDL模型組為16.45％±1.57％,兩組有顯著差異。肝組織羥脯氨酸含量結果顯示槐果堿干預

7、組較各模型組羥脯氨酸含量明顯下降,槐果堿干預DMN組肝組織羥脯氨酸含量為261.17±20.45μg/g肝濕重,DMN模型組為61.17±20.55μg/g肝濕重,兩組有顯著差異；槐果堿干預BDL組肝組織羥脯氨酸含量為163±17.03μg/g肝濕重,BDL模型組為259.33±23.18μg/g肝濕重,兩組有顯著差異。 3、槐果堿干預組肝組織中α-SMA、TGF-β1及I型前膠原α1mRNA表達較各模型組明顯降低,槐果堿干預D

8、MN組較DMN模型組上述mRNA表達分別下降31.9％、32.5％及29.3％；槐果堿干預BDL組較BDL模型組上述mRNA表達分別下降34.8％、21.8％及16.3％?；惫麎A干預組α-SMA及I型膠原蛋白表達較各模型組下降。 4、分離的大鼠HSC細胞得率為5～6×107/肝,細胞存活率95％以上,細胞純度90％以上。 5、用TGF-β1(1ng/ml)處理原代培養(yǎng)的HSC,可使HSC表達α-SMA、TGF-β1及I型

9、前膠原α1mRNA量明顯升高,而用200mg/L槐果堿干預后HSC表達α-SMA,TGF-β1及I型前膠原α1的mRNA量顯著降低,且400mg/L槐果堿組mRNA表達量明顯低于200mg/L槐果堿組,提示劑量依賴效應。200mg/L槐果堿干預72h后,HSC表達α-SMA蛋白較對照組下降。 5、400～1000 mg/L槐果堿對活化大鼠HSC增殖具有劑量、時間依賴的抑制作用。 研究結論: 1.以20mg/kg槐