子宮內(nèi)膜癌雌激素依賴型與非依賴型基因表達譜的初步研究.pdf

1、在美國，子宮內(nèi)膜癌(endometrialcarcinoma)是一種最常見的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，在所有的腫瘤中排名第四，僅次于乳腺癌、肺癌和大腸癌。2000年，美國大約新增36,100新病例，約有6,500死于這種疾病。我國子宮內(nèi)膜癌也已成為女性最常見的惡性腫瘤之一。 一般認(rèn)為，子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生與雌激素長期刺激有直接關(guān)系，是一種雌激素依賴性腫瘤，其發(fā)現(xiàn)較早，預(yù)后較好，5年生存率達70％左右。但在實際臨床工作中發(fā)現(xiàn)：部分患者，尤

2、其是絕經(jīng)后患者，并無內(nèi)源性或外源性高雌激素的表現(xiàn)，而且激素治療效果不好，預(yù)后較差。 本研究應(yīng)用美國Affymetrix公司制備的HumanGenomeU133Plus2.0原位合成寡核苷酸芯片(該基因芯片一共有54,614個探針組，分析47,000個轉(zhuǎn)錄本和變異體，其中包括了可能的38,500個已知基因)對子宮內(nèi)膜癌Ⅰ型(實驗組)和Ⅱ型(對照組)樣品各3例配對進行了檢測，希望能初步探討兩種亞型相應(yīng)的分子生物學(xué)標(biāo)志，進而為子宮內(nèi)膜

3、癌的診斷、治療和評估預(yù)后提供分子依據(jù)。 6例標(biāo)本總RNA被提取純化后，mRNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后體外轉(zhuǎn)錄合成cRNA并用生物素標(biāo)記，與寡核苷酸芯片進行雜交反應(yīng)。芯片圖像掃描后經(jīng)軟件處理，雜交信號以數(shù)據(jù)的形式輸出。掃描后的原始數(shù)據(jù)進一步經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化處理后得到標(biāo)準(zhǔn)化的各探針組的“報告信號值”。由于每個探針組由11-20個PM-MM探針對組成，如果要判定檢測樣品中基因的是否表達，需對探針組各PM-MM探針表達信號值行符號秩和檢驗(O

4、ne-sidedWilcoxon'sSignedRanktest)。當(dāng)探針組各PM-MM探針對表達信號檢驗P值＜0.04時，判定該基因或EST在樣品中表達(PresentP)；當(dāng)P值＞0.06時，判定該基因或EST在樣品中不表達(AbsentA)。該基因或EST介于表達與不表達之間時以(marginalM)代表。利用統(tǒng)計學(xué)方法比較子宮內(nèi)膜癌Ⅰ型和Ⅱ型兩種樣品之間探針雜交熒光強度比值，建立兩者之間的基因差異表達譜。 根據(jù)Affym

5、etrix基因芯片數(shù)據(jù)篩選標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)所有上調(diào)基因和EST序列為2,971個，其中差異倍數(shù)在一倍以上的有888，二倍以上的有222個；下調(diào)基因和EST為3,812，其中差異倍數(shù)在一倍以上的有2,301個，二倍以上的有742個。 隨后，基因芯片結(jié)果半定量RT-PCR驗證。6個基因被隨機選擇，其中CXCL5、LY6D和LEFTY1在子宮內(nèi)膜癌Ⅰ型中高表達，而IFNG、FGF1和ORM2子宮內(nèi)膜癌Ⅱ型中高表達。結(jié)果顯示，基本上所有的RT

6、-PCR檢測表現(xiàn)出與芯片結(jié)果一致的變化趨勢，表明了芯片結(jié)果的可重復(fù)性。 1.上調(diào)基因 1.1雌激素代謝和轉(zhuǎn)化基因： CYP2C9編碼了細胞色素P450超家族酶成員中的一員。細胞色素P450超家族為單加氧酶，能催化多種反應(yīng)，涉及代謝、合成膽固醇、類固醇和其它脂質(zhì)。CYP2C9定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，其表達受rifampin誘導(dǎo)。該酶是眾所周知的代謝phenytoin，tolbutamide，ibuprofen和S-warf

7、arin。研究鑒定有些個體在代謝phenytoin和tolbutamide能力很差，暗示該基因多態(tài)性。Modugno等利用半定量RT-PCR分析29對乳腺癌及臨近非癌組織¨CYPs(CYP1A1，CYP1A2，CYPB1，CYP2C8，CYP2C9，CYP2C18，CYP2C19，CYP2D6，CYP2E1，CYP3A4，andCYP3A5)mRNA表達發(fā)現(xiàn)，僅僅只有四個CYPs(CYP1A1，CYPB1，CYP2C9，CYP3A4)在

8、乳腺癌及臨近非癌組織能檢測到表達。其中CYP1A1，CYPB1，CYP3A4涉及了雌二醇羥基化作用，CYP2C9參與了雌酮硫酸鹽轉(zhuǎn)化為16-羥基硫酸鹽代謝。CYP2C9高表達是由于雌激素的高表達誘導(dǎo)所至，參與了雌激素的代謝。 脫氫表雄酮硫酸轉(zhuǎn)移酶(dehydroepiandrosteronesulfotransferaseDST)基因編碼黏附連接板蛋白plakin蛋白家族成員之一參與了類固醇激素硫酸化。許多類固醇激素硫酸化被發(fā)現(xiàn)

9、發(fā)生在胎兒和成人的幾處組織里。脫氫表雄酮硫酸鹽在發(fā)育中的胎兒中產(chǎn)量很高，認(rèn)為主要是人在懷孕狀態(tài)下高雌激素的緣故。Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌由于處于高雌激素刺激狀態(tài)，因此，DST表達也由于雌激素的原因而高表達，由此也認(rèn)為，該基因也會隨著雌激素含量的降低而表達下調(diào)。DST基因或許可以作為Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌的標(biāo)志物和治療反應(yīng)預(yù)后標(biāo)志物之一。 1.2雌激素調(diào)節(jié)基因 CFTR(cysticfibrosistransmembraneconducta

10、nceregulator)，又稱為ABCC7，是ABC轉(zhuǎn)運子超家族中MRP亞家族中成員之一，涉及了多藥耐藥。該蛋白是一種cAMP激活的氯離子通道，控制其它轉(zhuǎn)運通路的調(diào)節(jié)。這種基因突變在常染色體隱性疾病囊腫性纖維化和先天性雙側(cè)輸精管萎縮癥已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)。Rochwerger等首次報道了在活體內(nèi)小鼠子宮上皮中，CFTR表達調(diào)節(jié)是依賴于雌激素。隨后他們在體外，通過新建的子宮上皮細胞系證實，CFTR的表達由雌激素控制。Tsang發(fā)現(xiàn)，在無酚紅的培養(yǎng)

11、基中，forskolin-stimulatedI(SC)表達明顯下調(diào)，進一步在charcoal/dextran處理的fetalbovineserum(FBS)中，此時類固醇激素已經(jīng)被除掉，SC含量繼續(xù)降低。而forskolin-stimulatedI表達上調(diào)是由CFTR介導(dǎo)，這暗示了酚紅和類固醇激素可以上調(diào)CFTR的表達。CFTR在女性生殖管道中表達，但其在子宮中的功能一直不是很清楚。Rowlands等利用RT-PCR方法，通過在卵巢切

12、除的小鼠比較17beta雌二醇(17beta-oestradiol)和BakFoongPill(BFP)治療后CFTR在子宮中的表達水平來研究其生理作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，17beta雌二醇和BakFoongPill都能上調(diào)CFTRmRNA的表達。該結(jié)果暗示CFTR可以被雌激素誘導(dǎo)表達上調(diào)，顯示了CFTR可能在生殖功能中起了重要作用。子宮內(nèi)膜癌Ⅰ型是雌激素依賴型的惡性腫瘤，雌激素的持續(xù)刺激是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的主要原因。CFTR在子宮內(nèi)膜癌Ⅰ型中高表

13、達，反過來暗示了這型病人有雌激素的高表達。因此，CFTR或許可以作為該型的生物學(xué)標(biāo)志物之一，區(qū)分Ⅱ型子宮內(nèi)膜癌。 Wafa利用酵母雙雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)，DDC(L-dopadecarboxylase)能與AR(androgenreceptor)相互作用(AR是配體調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子，屬于類固醇受體家族，在前列腺的生長和發(fā)育上發(fā)揮了關(guān)鍵的作用)，增強類固醇受體的轉(zhuǎn)錄活性，或許與前列腺癌的發(fā)生有關(guān)。該基因表達在子宮內(nèi)膜癌Ⅰ型中表達，或許也是通過

14、類似作用，參與了雌激素(類固醇激素)依賴的子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生。 SOCS-3是細胞信號蛋白家族抑制子，負性調(diào)節(jié)細胞因子作用。Matthews等研究雌激素(E2)對T47D和MCF-7人乳腺癌細胞系中SOCS-3表達影響發(fā)現(xiàn)，ERalpha能直接調(diào)節(jié)人乳腺癌細胞中人SOCS-3啟動子的活性，因此調(diào)節(jié)細胞因子的活性。Leong等發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)的人肝細胞中，雌激素能以時間和劑量依賴的方式增加SOCS-3的表達。用雌激素長期處理野生型和ER

15、beta基因敲除小鼠中(3week)發(fā)現(xiàn)，肝臟SOCS-3被誘導(dǎo)表達升高2-3倍，而ERalpha基因敲除小鼠卻無SOCS-3表達上調(diào)。這暗示了雌激素通過ERalpha上調(diào)肝細胞SOCS-3的表達。該基因在子宮內(nèi)膜癌Ⅰ型中高表達，主要也是由于雌激素誘導(dǎo)所致，可能參與腫瘤的發(fā)病過程。 2.下調(diào)基因 Fos基因家族包括四個家族成員：FOS，F(xiàn)OSB，F(xiàn)OSL1和FOSL2。這些基因編碼亮氨酸拉鏈，能與JUN蛋白家族二聚體化，

16、形成轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物AP-1。FOS蛋白家族已經(jīng)牽涉到細胞的增殖、分化和轉(zhuǎn)化等。子宮內(nèi)膜癌Ⅱ型相對Ⅰ型更加惡劣，預(yù)后較差。FOSB在Ⅱ型子宮內(nèi)膜癌中相對高表達，支持該型腫瘤惡性程度較高。 NTRK2編碼神經(jīng)酪氨酸受體激酶家族成員之一。這種激酶是一種膜結(jié)合受體，能磷酸化自身以及MAPK通路成員，信號通過該激酶導(dǎo)致細胞增殖。該基因在Ⅱ子宮內(nèi)膜癌中高表達，可能參與了腫瘤細胞的增殖。JUN是一種癌基因，這種基因為推測性的鳥類肉瘤病毒17的

17、轉(zhuǎn)化基因。它編碼一種與病毒蛋白高度相似的基因，能直接與特異的靶DNA序列相互作用。Yokoyama等報道那些c-jun陽性病人與c-jun陰性病人相比較，預(yù)后更差。另外，他們還發(fā)現(xiàn)，c-jun的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，因此認(rèn)為c-jun能促進子宮內(nèi)膜癌轉(zhuǎn)移。Salmi在研究惡性子宮內(nèi)膜與正常周期的子宮內(nèi)膜時發(fā)現(xiàn)，c-jun和ER的表達相關(guān)性已經(jīng)丟失。Li等發(fā)現(xiàn)，在絕經(jīng)期后的子宮內(nèi)膜癌患者，相對于正常對照、絕經(jīng)后子宮出血和萎縮的子宮內(nèi)膜