子宮內(nèi)膜癌孕激素耐藥機(jī)制的研究.pdf

1、本研究利用雌孕激素受體陽性、對孕激素反應(yīng)良好的子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞，以MPA為誘導(dǎo)劑，采用持續(xù)作用、梯度遞增的方法誘導(dǎo)孕激素耐藥的Ishikawa細(xì)胞亞系的建立，探討雌孕激素受體表達(dá)的改變及TGFa／EGF-EGFR信號(hào)通路活性的增強(qiáng)在孕激素耐藥發(fā)生中的作用，為子宮內(nèi)膜癌合理、安全、有效的保守治療提供理論依據(jù)。 第一部分子宮內(nèi)膜癌孕激素耐藥細(xì)胞的建立及及其生物學(xué)特點(diǎn) 目的建立子宮內(nèi)膜癌孕激素耐藥細(xì)胞，并研究其生

2、物學(xué)特點(diǎn)。 方法利用子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞，以MPA為誘導(dǎo)劑，采用濃度遞增(1—10gM)、持續(xù)給藥的方法誘導(dǎo)建立子宮內(nèi)膜癌孕激素耐藥細(xì)胞；應(yīng)用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法、流式細(xì)胞技術(shù)(FACS)及Brdu摻入法檢測孕激素對母代Ishikawa細(xì)胞及孕激素耐藥細(xì)胞增殖的影響；Transwell小室檢測MPA對母代Ishikawa細(xì)胞及耐藥細(xì)胞侵襲能力的影響；RT-PCR技術(shù)及Westem-blot技術(shù)檢測MPA對母代Is

3、hikawa細(xì)胞及耐藥細(xì)胞CyclinDl表達(dá)的影響；RT-PCR技術(shù)及明膠酶譜技術(shù)檢測MPA對母代Ishikawa細(xì)胞及耐藥細(xì)胞MMP2、MMP9表達(dá)及活性的影響。 結(jié)論MPA的長期作用能夠?qū)е聦υ屑に匾种谱饔妹舾械腎shikawa細(xì)胞對MPA耐藥，一旦耐藥發(fā)生，MPA可能通過增強(qiáng)CyclinDl、MMP2、MMP9表達(dá)及提高M(jìn)MP2活性促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲能力。提示用孕激素保守治療子宮內(nèi)膜癌是可行的，但要警惕長期用藥孕激素

4、耐藥的發(fā)生。 第二部分雌、孕激素受體表達(dá)的改變及EGFR信號(hào)通路活性增強(qiáng)與孕激素耐藥發(fā)生的關(guān)系 目的探討雌、孕激素受體亞型表達(dá)的改變及內(nèi)源性生長因子TGFa及其受體EGFR表達(dá)的提高及活性的增強(qiáng)與孕激素耐藥發(fā)生的關(guān)系。 方法采用免疫細(xì)胞化學(xué)、RT-PCR、Western-blot法檢測耐藥細(xì)胞及母代Ishikawa細(xì)胞ER、PR亞型的表達(dá)及EGFR的表達(dá)；RT-PCR檢測兩株細(xì)胞TGFa的表達(dá)及MPA對兩株細(xì)胞T

5、GFa表達(dá)的影響；Western-blot檢測兩株細(xì)胞EGFR-TK的表達(dá)情況；MTT及流式細(xì)胞術(shù)檢測EGFR-TK抑制劑AGl478對兩株細(xì)胞增殖的影響；RT-PCR、Westem-blot檢測AGl478對兩株細(xì)胞CyclinDl表達(dá)的影響；RT-PCR檢測AGl478對兩株細(xì)胞MMP2、MMP9表達(dá)的影響。 結(jié)果(1)與母代Ishikawa細(xì)胞相比，耐藥細(xì)胞ERa、PRB的陽性表達(dá)率明顯下降，ERβ的陽性表達(dá)率增加(均有P

6、<0．05)(2)耐藥細(xì)胞TGFa、EGFR的表達(dá)水平高于母代Ishikawa細(xì)胞(均有P<0．05)，且耐藥細(xì)胞EGFR自身酪氨酸磷酸化的水平也高于母代Ishikawa細(xì)胞。(3)MPA下調(diào)母代Ishikawa細(xì)胞TGFa表達(dá)，上調(diào)耐藥細(xì)胞TGFa表達(dá)。(4)MTT結(jié)果顯示AGl478抑制耐藥細(xì)胞的增生，抑制作用成濃度依賴性(F=18．148，P=O．00；各用藥組與對照相比均有P<0．05)，而較低濃度的AGl478對母代Ishik

7、awa細(xì)胞沒有明顯的抑制作用，高濃度(10p．M)的AGl478顯示出抑制作用(P=0．009)。細(xì)胞周期分析結(jié)果表明AGl478可阻滯耐藥細(xì)胞于G1期，AGl478作用24、48、72h抑制率分別為19．4％、¨．2％、10．7％(均有P<0．05)，而對母代Ishikawa細(xì)胞細(xì)胞周期分布沒有明顯影響，僅于作用48h顯示出阻抑作用(t=5．074，P=0．037)，抑制率為9％。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明AGl478抑制母代Ishikaw

8、a細(xì)胞及耐藥細(xì)胞的侵襲能力，抑制效率分別為42．4％士4．1％及58．1％4-6．9％(t=6．083,P=0．026；t=38．105,P=0．001)，對耐藥細(xì)胞侵襲能力的抑制效率要高于母代Ishikawa細(xì)胞(t=4．614,P=0．044)。(5)耐藥細(xì)胞及母代Ishikawa細(xì)胞經(jīng)AGl478作用48h后，CyclinDl、MMP2、MMP9三種基因的表達(dá)均下降，在母代Ishikawa細(xì)胞中的表達(dá)分別下降為原水平的0．767、

9、0．336及0．348倍，在耐藥細(xì)胞中的表達(dá)分別下降為原水平的0．45、0．022、O．148倍。與母代Ishikawa細(xì)胞相比，AGl478引起的耐藥細(xì)胞CyclinDl、MMP2、MMP9表達(dá)的下降程度均高于母代Ishikawa細(xì)胞(均有P<0．05)。 結(jié)論(1)ERa表達(dá)的下降，ERβ表達(dá)的升高、PRB表達(dá)的下降及TGFa．EGFR信號(hào)通路活性增強(qiáng)可能參與了子宮內(nèi)膜癌孕激素耐藥的發(fā)生。(2)EGFR-TK抑制劑有望成為孕

10、激素耐藥子宮內(nèi)膜癌的一種新型有效的治療方法。 第三部分外源性生長因子TGFa、EGF與子宮內(nèi)膜癌孕激素耐藥發(fā)生的關(guān)系 目的探討外源性生長因子TGF~EGF對子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞孕激素作用的影響。 方法采用MTT法、劃痕實(shí)驗(yàn)檢測TGFa／EGF、MPA及TGF~EGF聯(lián)合MPA對母代Ishikawa細(xì)胞增殖、遷移運(yùn)動(dòng)能力的影響；Western-blot檢測TGF~EGF、MPA及TGF~EGF聯(lián)合MPA對

11、母代Ishikawa細(xì)胞CyclinDl、E-cadherin蛋白表達(dá)的影響；RT-PCR及Western-blot技術(shù)檢測TGFgEGF及MPA對母代Ishikawa細(xì)胞PRB表達(dá)的影響；Western-blot技術(shù)檢測TGFa／EGF刺激MAPK磷酸化的情況及MPA預(yù)作用48h對TGFgEGF刺激MAPK磷酸化強(qiáng)度的影響。 結(jié)果(1)TGF~EGF促進(jìn)母代Ishikawa細(xì)胞的增殖、遷移運(yùn)動(dòng)能力，MPA抑制母代Ishikaw

12、a細(xì)胞的增殖及遷移運(yùn)動(dòng)能力，與對照相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)，TGF~EGF聯(lián)合MPA促進(jìn)母代Ishikawa細(xì)胞的增殖、遷移運(yùn)動(dòng)能力，與單用TGFa、EGF組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0．05)。(2)TGFa、EGF促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白CyclinDl的表達(dá)，下調(diào)E-cadherin的表達(dá)，MPA與TGFa、EGF的作用相反，降低CyclinDl的表達(dá)，促進(jìn)E-cadherin的表達(dá)，TGFa／EGF聯(lián)合MPA與TGFa、EGF

13、單獨(dú)作用的結(jié)果相一致，引起CyclinDl表達(dá)的上調(diào)及E-cadherin表達(dá)的下調(diào)。(3)TGFa、EGF、MPA均下調(diào)PRB的表達(dá)，下調(diào)作用具有劑量依賴性，小劑量的生長因子TGFa(1ng／m1)、EGF(1ng／m1)、MPA(0．1gM)即能引起PRB表達(dá)的下降，隨著劑量的增加，下調(diào)作用愈明顯。TGFa、EGF作用12h，PRB表達(dá)下降，24h達(dá)到最低點(diǎn)；MPA作用6h，PRB表達(dá)開始下降，24h達(dá)到最低點(diǎn)，與對照相比差異均有統(tǒng)

14、計(jì)學(xué)意義(P<0．05)，之后表達(dá)又逐漸恢復(fù)，但不能恢復(fù)至原來水平。(4)TGFa、EGF能激活MAPK的活性分子P-ERK的表達(dá)，MPA預(yù)作用于母代Ishikawa細(xì)胞48h，此時(shí)再加入生長因子TGF~EGF作用5min、15min、30min，P-ERK的表達(dá)強(qiáng)度要高于無血清預(yù)處理組(不含MPA)。 結(jié)論(1)外源性生長因子TGFgEGF促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞的增殖、遷移運(yùn)動(dòng)能力，拮抗MPA的抑制作用，可能通過上

15、調(diào)CyclinDl的表達(dá)及下調(diào)E-cadherin的表達(dá)而發(fā)揮作用。(2)MPA抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖及侵襲能力，下調(diào)CyclinDl的表達(dá)及上調(diào)E-cadherin的表達(dá)，卻不能拮抗生長因子的促進(jìn)作用及其引起的CyclinDl表達(dá)的升高及E-cadherin表達(dá)的下降。(3)生長因子TGFa／EGF與MPA都能夠下調(diào)Ishikawa細(xì)胞PRB的表達(dá)，降低了細(xì)胞對MPA的反應(yīng)，且MPA的預(yù)作用增強(qiáng)了生長因子TGFa／EGF刺激MAPK

16、磷酸化的強(qiáng)度。 上述結(jié)果提示：MPA的長期作用能夠?qū)е聦υ屑に匾种谱饔妹舾械腎shikawa細(xì)胞對MPA耐受，雌孕激素受體亞型表達(dá)的失衡及內(nèi)外源性TGF~EGF-EGFR信號(hào)通路活性的增強(qiáng)可能為子宮內(nèi)膜癌孕激素耐藥發(fā)生的機(jī)制之一。一旦耐藥發(fā)生，MPA可能通過增強(qiáng)CyclinDl、MMP2、MMP9表達(dá)及提高M(jìn)MP2活性促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖、侵襲能力。在耐藥發(fā)生過程中，子宮內(nèi)膜癌由激素依賴型轉(zhuǎn)為生長因子依賴型。EGFR-TK抑