CD88在肝癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及其機制.pdf

1、肝癌是國內(nèi)常見的惡性腫瘤之一，其侵襲轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)是患者死亡的主要原因之一。因此，探索肝癌侵襲轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)的發(fā)生機制，尋求有效的抗肝癌轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)治療措施，對改善肝癌患者的預(yù)后具有重要意義。
　　研究依據(jù)：CD88又稱補體5片段受體(complement component5a receptor，C5aR)，是一種在細(xì)胞膜表面的G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)，其在體內(nèi)主要分布在髓來源細(xì)胞系，參與一系列炎癥反應(yīng)過程，如趨化作用，促進(jìn)多種細(xì)胞的釋

2、放反應(yīng)(如前列腺素、5-HT、組胺、IL-1、IL-6等)，增加血管通透性等。近來研究發(fā)現(xiàn)CD88在肝臟再生實質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，并且在肝損傷后的肝細(xì)胞再生修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用。CD88還參與了細(xì)胞抗失巢凋亡、新生血管生成等。CD88與其配體C5a結(jié)合后可激活下游的G蛋白、WASP、β-arresting等信號分子，引起P13K/AKT、Ras/Raf/MEK/ERK和c-Src/JAK等信號通路反應(yīng)，可激活CREB、NF-κB、STAT3

3、等核轉(zhuǎn)錄因子。近來研究發(fā)現(xiàn)CD88在乳腺癌、肺癌、腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤組織中表達(dá)較正常組織明顯升高。Markiewski等報道在小鼠子宮頸癌模型中，通過補體5敲除或CD88拮抗劑應(yīng)用后小鼠子宮頸癌腫瘤的增殖明顯受到抑制，其機制可能與微環(huán)境中髓來源抑制細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSC)增加并抑制腫瘤微環(huán)境中CD8+T細(xì)胞的數(shù)量和功能。在我所前期實驗中發(fā)現(xiàn)Micro-RNA26表達(dá)較低的肝癌患者預(yù)后較

4、高表達(dá)的患者預(yù)后差，通過對兩者基因芯片掃描結(jié)果顯示低表達(dá)Micro-RNA26的癌組織較高表達(dá)Micro-RNA26的癌組織中CD88表達(dá)明顯升高，這提示低表達(dá)Micro-RNA26可能通過上調(diào)CD88表達(dá)的同時上調(diào)IL-6、NF-κB促進(jìn)腫瘤發(fā)展。
　　但迄今為止，它對肝癌的影響尚未有明確報道。本實驗首先在肝癌、相應(yīng)癌旁組織以及不同轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞系中檢測CD88表達(dá)差異；研究其與肝癌發(fā)生、發(fā)展以及預(yù)后的相關(guān)性；通過轉(zhuǎn)染與干擾調(diào)

5、節(jié)CD88表達(dá)后，探討CD88與肝癌細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移的關(guān)系。
　　第一部分 CD88在肝癌組織及肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)研究
　　目的：研究CD88在肝癌細(xì)胞株及肝癌、相應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)差異，初步分析其與肝癌發(fā)生的關(guān)系。
　　方法：應(yīng)用熒光定量PCR、免疫組織化學(xué)及Western Blot方法檢測CD88在56例肝癌、相應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)。應(yīng)用熒光定量PCR、Western Blot及免疫熒光檢測不同轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞的CD8

6、8表達(dá)情況。
　　結(jié)果：熒光定量PCR顯示CD88在肝癌、相應(yīng)癌旁中的相對表達(dá)量分別為0.056±0.014 vs.0.003±0.0004，肝癌與癌旁兩者間差異明顯(p<0.001)。Western Blot結(jié)果同樣顯示肝癌組織CD88表達(dá)高于癌旁組織(3.71±0.92 vs.0.91±0.34，p<0.01)；在肝癌組織中早期復(fù)發(fā)組CD88表達(dá)要明顯高于非早期復(fù)發(fā)組(4.43±0.48 vs.1.64±0.28，p<0.05

7、)。免疫組織化學(xué)顯示兩者都有CD88表達(dá)，但肝癌組織中的表達(dá)明顯高于后者　　結(jié)論：CD88在肝癌發(fā)生發(fā)展中可能有重要作用。
　　第二部分CD88表達(dá)與肝癌臨床病理特征及相關(guān)性研究
　　目的：研究CD88在原發(fā)性肝癌中的表達(dá)情況，探討CD88在肝癌組織中表達(dá)的相關(guān)

8、性、與原發(fā)性肝癌的關(guān)系及臨床生物學(xué)意義。
　　方法：組織芯片檢測403例肝癌組織中CD88的表達(dá)，統(tǒng)計分析其與肝癌臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。
　　結(jié)果：CD88蛋白的過表達(dá)與肝癌患者的血漿高AFP水平、腫瘤直徑大于5cm、有肉眼癌栓、高BCLA臨床分期和高CLIP分期等臨床病理因素有明顯關(guān)聯(lián)(p<0.05)。CD88表達(dá)陽性組的7年總體生存率及無病生存率明顯低于CD88陰性組(p<0.05)，分層Kaplan-Meier分析

9、顯示在高AFP組、單個腫瘤組、高腫瘤分化組、無微血管侵犯組中肝癌組織中CD88過表達(dá)患者OS和DFS均較低表達(dá)組差。多因素分析表明血清GGT>54U/L、血清AFP>20ng/ml、有肝硬化、腫瘤直徑>5cm、多個腫瘤、有微血管癌栓及CD88表達(dá)陽性是影響OS的獨立預(yù)后因素；血清GGT>54U/L、血清AFP>20ng/ml、有肝硬化、多個腫瘤、有微血管癌栓及CD88表達(dá)陽性等為DFS的獨立預(yù)后因素。
　　結(jié)論：CD88與原發(fā)性肝

10、癌的侵襲、轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后相關(guān)。
　　第三部分調(diào)節(jié)CD88表達(dá)對肝癌細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移的影響
　　目的：研究CD88與肝癌細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移的關(guān)系。
　　方法：轉(zhuǎn)染pReceiver-M55-CD88 cDNA和GPHI/GFP/Neo-CD88-shRNA，篩選出穩(wěn)定細(xì)胞株，經(jīng)western blot，qRT-PCR驗證CD88表達(dá)改變后，C5a刺激試驗研究基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP2、9)及血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)mRNA變

11、化；MTT檢測CD88表達(dá)改變后，細(xì)胞增殖能力變化；Transwell研究細(xì)胞遷移侵襲能力變化。細(xì)胞接種于裸鼠肝原位，研究CD88改變后，細(xì)胞成瘤與肺轉(zhuǎn)移能力的改變：免疫組化檢測移植瘤的CD88、MMP9和VEGF表達(dá)。
　　結(jié)果：轉(zhuǎn)染pReceiver-M55-CD88 cDNA和GPHI/GFP/Neo-CD88-shRNA于低轉(zhuǎn)移能力的HepG2與高轉(zhuǎn)移的HCCLM3，G418篩選出穩(wěn)定細(xì)胞株，Western blot和qR

12、T-PCR驗證CD88表達(dá)明顯上調(diào)或下調(diào)；Transwell實驗結(jié)果顯示上調(diào)或下調(diào)CD88表達(dá)后的肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力明顯增加或減少；rC5a刺激后細(xì)胞mRNA研究顯示CD88的表達(dá)與MMP2，MMP9，VEGF的分泌呈正相關(guān)。CD88表達(dá)水平對肝癌細(xì)胞增殖有一定影響。高表達(dá)CD88的肝癌細(xì)胞體內(nèi)成瘤能力較低表達(dá)肝癌細(xì)胞明顯上升，高CD88表達(dá)組細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移灶明顯增加，且以Ⅲ、Ⅳ期為主；下調(diào)HCCLM3的CD88后較對照組MMP9和