天麻素在脊髓背角的鎮(zhèn)痛作用及其突觸機(jī)制研究.pdf

1、慢性痛是一類慢性疾病，反復(fù)發(fā)作、遷延難治，嚴(yán)重危害人類身心健康和生活質(zhì)量，慢性痛相關(guān)的醫(yī)療花費十分巨大。持續(xù)的慢性痛會危及患者的人際關(guān)系和社交活動，將逐漸導(dǎo)致患者產(chǎn)生焦慮、抑郁、恐懼等惡性情緒，“痛”不欲生。近年來，慢性痛的機(jī)制研究雖然取得長足進(jìn)展，但是，當(dāng)前臨床上的主流鎮(zhèn)痛藥非甾體類抗炎藥(NSAIDs)和阿片類鎮(zhèn)痛藥存在許多局限性，不能滿足患者的需求。因此，研究和揭示慢性痛的本質(zhì)和發(fā)病機(jī)制，研制新型鎮(zhèn)痛藥具有重要的醫(yī)學(xué)意義和社會意義

2、。
　　脊髓背角淺層(SDH)對疼痛等傷害性信息向大腦的傳遞起重要的整合和敏化作用，其內(nèi)的神經(jīng)元及其突起相互聯(lián)系形成重要的興奮性環(huán)路和抑制性環(huán)路，我們課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)脊髓背角Ⅰ層神經(jīng)元的突觸可塑性改變在慢性痛的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。因此，脊髓背角Ⅰ層神經(jīng)元是鎮(zhèn)痛藥物的潛在作用靶點之一。
　　天麻素(Gastrodin，GAS)是從我國傳統(tǒng)中草藥“天麻”中分離出的主要活性成分之一，具有抗癲癇、抗驚厥、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛和神經(jīng)

3、保護(hù)等作用。近年來，系列臨床報道GAS可以顯著地緩解三叉神經(jīng)痛、偏頭痛、糖尿病性神經(jīng)痛、血管性頭痛等頑固性慢性痛。研究報道 GAS對痛覺初級傳入神經(jīng)元——背根節(jié)(DRG)的興奮性發(fā)揮顯著抑制作用，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)其機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)電壓依賴性鈉、鉀通道以及酸敏感性陽離子通道的功能狀態(tài)來實現(xiàn)的。然而GAS對慢性炎性痛有無鎮(zhèn)痛作用，發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用的細(xì)胞和分子機(jī)制是什么，目前的研究報道很少。因此，研究和探討GAS在慢性痛中的作用及其中樞鎮(zhèn)痛作用機(jī)

4、制有望為其臨床應(yīng)用提供重要的科學(xué)依據(jù)和理論指導(dǎo)。
　　第一部分：探討GAS對炎性痛小鼠自發(fā)痛和痛覺過敏的影響
　　目的：觀察GAS對炎性痛小鼠的鎮(zhèn)痛作用。
　　方法：成年雄性小鼠一側(cè)足底皮下注射（s.c.）蜜蜂毒或完全弗氏佐劑（CFA）建立病理性疼痛模型，自發(fā)痛行為在蜜蜂毒注射即刻開始測試，觸誘發(fā)痛和痛覺過敏分別在CFA注射后不同時間點進(jìn)行測試。
　　結(jié)果：腹腔注射（i.p.）不同濃度的GAS（50,100,20

5、0 mg/kg）或生理鹽水，與對照組相比GAS呈劑量依賴性地抑制蜜蜂毒誘致的自發(fā)痛和CFA誘致的觸誘發(fā)痛、機(jī)械性痛敏和熱痛敏（n=5-8 per group，P<0.05，one-way ANOVA）。而且GAS發(fā)揮的鎮(zhèn)痛作用不被納洛酮所阻斷，提示其發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用不依賴于阿片μ受體，并且長期用藥無耐受性產(chǎn)生。與對照組相比，鞘內(nèi)注射GAS(10 mM，i.t.)顯著地降低CFA誘致的觸誘發(fā)痛、機(jī)械痛敏和熱痛敏（n=6 per group，P

6、<0.05，one-way ANOVA）。然而，注射GAS（200 mg/kg，i.p.）對正常小鼠的基礎(chǔ)痛閾和運動平衡協(xié)調(diào)能力均無顯著影響（n=5-8 mice per group，P>0.05，one-way ANOVA）。
　　第二部分：探討GAS對炎性痛小鼠脊髓背角c-Fos表達(dá)的影響
　　目的：為了進(jìn)一步獲得GAS在脊髓發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用的證據(jù)，我們用評估神經(jīng)元活動的功能標(biāo)志物進(jìn)行了第二部分實驗。
　　方法：上述小

7、鼠建立蜜蜂毒模型后2 h，灌注取腰膨大處脊髓，后固定，脫水，冰凍切片，免疫組化ABC法染色。
　　結(jié)果：蜜蜂毒誘致的病理性痛小鼠L4-L5節(jié)段脊髓背角c-Fos表達(dá)呈現(xiàn)顯著的上調(diào)，疼痛的初級傳入纖維末梢主要終止的部位脊髓背角淺層（I-II）和深層（IV-V） c-Fos密度明顯升高。與對照組相比，腹腔注射GAS（50,100，200 mg/kg，i.p.）呈劑量依賴性地抑制脊髓背角淺層和深層神經(jīng)元 c-Fos的表達(dá)（P<0.05，

8、one-way ANOVA），并且其對淺層的抑制作用比深層更顯著。
　　第三部分：探討GAS對SDHI層神經(jīng)元興奮性突觸傳遞和神經(jīng)元興奮性的影響
　　目的：為了探究GAS緩解炎性痛的機(jī)制，我們進(jìn)一步評估了GAS對興奮性突觸傳遞和神經(jīng)元興奮性的影響。
　　方法：取出生后14-18 d小鼠，建立CFA模型，24 h后制作帶有背根的脊髓橫斷面切片，對SDH I層神經(jīng)元進(jìn)行全細(xì)胞膜片鉗記錄，觀察灌流給予GAS（300μM）對慢

9、性痛小鼠興奮性突觸傳遞及神經(jīng)元超興奮性的影響，記錄刺激背根誘發(fā)的興奮性突觸后電流（eEPSCs）、微小興奮性突觸后電流（mEPSCs）、C纖維誘發(fā)的eEPSCs（C-eEPSCs）的雙脈沖比值（PPR）和SDH I層神經(jīng)元的主動膜特性和被動膜特性。
　　結(jié)果：（1）與正常小鼠相比，慢性炎性痛后 C-eEPSCs的峰值幅度隨刺激強(qiáng)度變化反應(yīng)曲線（I-O曲線）明顯左移和上移，給予GAS慢性炎性痛小鼠脊髓背角66.7％(10/15) I

10、層神經(jīng)元的C-eEPSCs峰值幅度被顯著抑制，統(tǒng)計分析顯示GAS的平均抑制率為29.18±3.23%（n=10 neurons/7 mice，P<0.05，paired-t test）。（2）與正常小鼠相比，CFA誘致的炎性痛小鼠 mEPSCs的放電頻率明顯增加，其頻率被 GAS顯著抑制，平均抑制率為47.5?7.66%（n=7 neurons/4 mice，P<0.05，paired-t test)，而GAS對其幅度無顯著影響；而且G

11、AS引起慢性炎性痛小鼠C-eEPSCs的PPR發(fā)生顯著變化。這二者均強(qiáng)烈提示 GAS發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用是突觸前效應(yīng)。（3）鑒于 GAS對炎性痛小鼠初級傳入突觸增強(qiáng)起抑制作用，接下來我們探討GAS對初級傳入突觸后的脊髓背角 I層神經(jīng)元興奮性和膜特性的影響。發(fā)現(xiàn)與正常小鼠相比，CFA炎性痛小鼠 SDH I層神經(jīng)元在注入電流條件下興奮性明顯升高，具體表現(xiàn)為動作電位（AP）的放電頻率增加、半寬減小、最大上升斜率增大、閾值下降、基強(qiáng)度降低。CFA炎性痛

12、后SDH I層神經(jīng)元的被動膜特性（膜電容Cm，膜電阻Rm，靜息膜電位RMP）無顯著變化（n=16 neurons/10 inflamed mice vs n=16 neurons/5 control mice，P<0.05，one-way ANOVA）。GAS能逆轉(zhuǎn)慢性炎性痛小鼠SDH I層神經(jīng)元的興奮性，例如GAS使AP的頻率、半寬、最大上升斜率、閾值及基強(qiáng)度恢復(fù)正常（n=10 neurons/8 inflamed mice vs n

13、=11 neurons/5 control mice，P<0.05，paired-t test）。而且我們發(fā)現(xiàn)CFA炎性痛小鼠脊髓背角28%（7/25）I層神經(jīng)元在未注入電流條件下產(chǎn)生自發(fā)放電，GAS顯著抑制自發(fā)放電的頻率，其平均抑制率為33.04±7.67%（n=7 neurons/4
　　mice，paired-t test)，GAS對其幅度影響無顯著性差異。（4）與對炎性痛小鼠顯著抑制作用不同的是GAS對正常小鼠SDH I層

14、神經(jīng)元的C-eEPSCs的幅度、mEPSCs的頻率和幅度、C-eEPSCs的PPR的改變以及主動膜特性和被動膜特性均無顯著影響。
　　結(jié)論：
　　1，GAS(i.p.)顯著抑制炎性痛小鼠的自發(fā)痛、觸誘發(fā)痛和痛覺過敏；GAS(i.t.)在脊髓水平發(fā)揮強(qiáng)有力的鎮(zhèn)痛作用；GAS(i.p.)不影響正常小鼠的基礎(chǔ)痛閾和運動協(xié)調(diào)能力。提示GAS是選擇性地抑制病理痛而對生理痛無顯著影響的良好鎮(zhèn)痛藥。
　　2，GAS(i.p.)呈劑量

15、依賴性地抑制炎性痛小鼠脊髓背角 c-Fos的表達(dá)上調(diào)，提示GAS對傷害性刺激誘致的脊髓背角神經(jīng)元活動的增強(qiáng)具有顯著的抑制作用。
　　3，灌流GAS顯著抑制炎性痛后脊髓背角I層神經(jīng)元興奮性突觸傳遞的可塑性增強(qiáng)。GAS明顯抑制炎性痛小鼠mEPSCs的頻率并且誘致C-eEPSCs的PPR發(fā)生顯著變化，二者均強(qiáng)烈提示GAS抑制突觸可塑性增強(qiáng)很可能是突觸前機(jī)制。
　　4，GAS顯著逆轉(zhuǎn)慢性炎性痛小鼠SDH I層神經(jīng)元的興奮性增強(qiáng)；GA