2023年全國(guó)碩士研究生考試考研英語(yǔ)一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁(yè)
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文檔簡(jiǎn)介

1、研究背景:
   癌性疼痛是晚期癌癥患者最常見(jiàn)的癥狀之一,由于受到生理、情感、認(rèn)知、行為和社會(huì)文化等因素的影響,因而具有很大的易變性和主觀性。骨癌痛是一種性質(zhì)劇烈、燒灼樣且伴有嚴(yán)重負(fù)性情緒反應(yīng)的疼痛,常伴有骨折和其他骨骼相關(guān)性疾病的發(fā)生,并最終導(dǎo)致患者生活質(zhì)量的嚴(yán)重降低和死亡率的上升。目前對(duì)于骨癌痛的治療已有多種治療方法,如癌痛的三階梯治療方案、放療、化療以及手術(shù)等,但仍有很大一部分骨癌痛患者其疼痛程度沒(méi)能得到有效的緩解,同時(shí)這

2、些傳統(tǒng)的治療方法往往也伴有大量的副作用,例如阿片類藥物容易引起便秘、藥物成癮以及阿片類藥物治療過(guò)程中的認(rèn)知功能障礙等;放療及化療過(guò)程中在抑制或殺傷癌細(xì)胞的同時(shí),對(duì)機(jī)體內(nèi)正常細(xì)胞也有毒害作用等等,因此極有必要尋求一種基于機(jī)制性的、力求能達(dá)到高效、作用持久、毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)的新的治療方案。
   脊髓是外周傷害性信息傳遞及調(diào)控的初級(jí)中樞之一,尤其是脊髓Ⅱ?qū)樱趥π孕畔⒌膫鬟f、整合過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用,觀察它們?cè)谥袠胁课坏耐渡浼捌?/p>

3、所含化學(xué)物質(zhì)的變化,對(duì)于闡明傷害性信息的傳遞和調(diào)控機(jī)制,具有重要意義。大量的研究結(jié)果表明,脊髓背角組織中的蛋白激酶Cγ(protein kinase Cγ,PKCγ)不僅僅參與了脊髓水平傷害性信息的傳遞與調(diào)制,而且促進(jìn)了脊髓敏化的形成和發(fā)展,在慢性疼痛的產(chǎn)生和/或維持中PKCγ可能發(fā)揮著重要的作用,因此若能有效降低PKCγ的表達(dá),或許能夠獲得良好的鎮(zhèn)痛效果。
   RNA干擾(RNA interference,RNAi)技術(shù)是近

4、幾年發(fā)展起來(lái)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默技術(shù) (post-transcriptional gene silencing,PTGS),它利用小片段雙鏈RNA (double short RNA,dsRNA)即小干擾RNA(short interfering RNA,siRNA),特異性降解相應(yīng)序列的mRNA,從而高效、特異性的沉默相應(yīng)基因的表達(dá)。RNAi作為一種細(xì)胞水平的基因敲除工具,業(yè)已成為研究?jī)?nèi)源性基因功能和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的有效手段,但如何能持久有

5、效地發(fā)揮其降解相應(yīng)序列mRNA的作用,仍是此技術(shù)面臨的最大障礙之一。
   慢病毒載體是常用的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng),具有能感染非分裂期細(xì)胞和分裂期細(xì)胞的特性,一旦病毒與細(xì)胞結(jié)合,病毒的基因則可整合到細(xì)胞的基因組中,成為基因遺傳的穩(wěn)定組成部分,從而可在細(xì)胞的分裂過(guò)程中傳給子代,同時(shí)其致病基因已經(jīng)剔除,重組野生困難,因而用慢病毒載體表達(dá)siRNA能安全持久地發(fā)揮下調(diào)目的基因表達(dá)的作用,可用于離體實(shí)驗(yàn)和在體實(shí)驗(yàn)。
   基于以上理論基

6、礎(chǔ),本研究擬通過(guò)以下四部分的研究,來(lái)評(píng)價(jià)siRNA干擾下調(diào)骨癌痛大鼠脊髓背角組織中PKCγ表達(dá)的鎮(zhèn)痛效應(yīng):1:制作骨癌痛大鼠模型,觀察PKCγ在骨癌痛大鼠脊髓背角組織中的表達(dá)變化及大鼠疼痛行為學(xué)的改變(包括機(jī)械縮爪閾值和機(jī)械縮爪持續(xù)時(shí)間),探討PKCγ上調(diào)值與大鼠疼痛程度改變之間是否具有某種關(guān)系,以此初步探討PKCγ在骨癌痛的產(chǎn)生和/或維持中是否發(fā)揮了一定的作用;2:在第一部分研究的基礎(chǔ)上,將PKCγ特異性抑制劑GF109203X注入骨

7、癌痛模型大鼠蛛網(wǎng)膜下腔,觀察PKCγ功能被抑制后,骨癌痛大鼠疼痛程度是否顯著減輕,從而推斷PKCγ在骨癌痛發(fā)病機(jī)制中的作用;3:根據(jù)大鼠PKCγ-mRNA序列,設(shè)計(jì)并構(gòu)建3個(gè)大鼠PKCγ基因的shRNA慢病毒載體,并在體外鑒定其干擾效率,篩選出一個(gè)有效的干擾靶點(diǎn),為下一步試驗(yàn)提供試驗(yàn)基礎(chǔ);4:將有效靶點(diǎn)的慢病毒載體注射到骨癌痛模型大鼠蛛網(wǎng)膜下腔,評(píng)價(jià)其鎮(zhèn)痛效應(yīng),為慢性疼痛的轉(zhuǎn)基因治療和siRNA的在體試驗(yàn)提供理論基礎(chǔ)。
   研

8、究方法與結(jié)果
   1. 骨癌痛大鼠脊髓背角蛋白激酶Cγ表達(dá)的變化及意義方法: 選取成年雌性Wistar大鼠64只,隨機(jī)分為三組,正常對(duì)照組(Naive組,n=16):未作任何處理的健康大鼠;假手術(shù)組(Sham組,n=16):大鼠右側(cè)脛骨上段骨髓腔注射熱滅活的Walker256細(xì)胞10μl;骨癌痛模型組(Cancer-induced bone pain,CIBP組,n=32):大鼠右側(cè)脛骨上段骨髓腔注入Walker256細(xì)胞10

9、μl (4×104 cells)制作骨癌痛模型。模型制作前一天及術(shù)后21天內(nèi)每隔3天觀察各組大鼠疼痛行為學(xué)變化(包括機(jī)械縮爪閾值和機(jī)械縮爪持續(xù)時(shí)間),且各組大鼠分別在術(shù)前一天(-1d)及手術(shù)后第6、15、21天灌注后取脊髓L4~6節(jié)段組織(每個(gè)時(shí)點(diǎn)隨機(jī)選擇4只),冰凍切片后作免疫組織化學(xué)DAB染色以檢測(cè)脊髓背角組織中PKCγ的表達(dá);同時(shí)對(duì)骨癌痛模型組大鼠于術(shù)前一天及手術(shù)后第6、15、21天,各選4只大鼠取脊髓L4~6節(jié)段組織作Weste

10、rn blot分析以檢測(cè)PKCγ的表達(dá)變化,探討PKCγ上調(diào)值與時(shí)間相關(guān)的大鼠疼痛程度改變之間是否具有某種關(guān)系。
   2. 鞘內(nèi)注射PKCγ抑制劑GF109203X對(duì)骨癌痛大鼠痛覺(jué)的影響方法:選取成年雌性Wistar大鼠30只,隨機(jī)分為五組(每組6只),對(duì)照組(Naive組):隨機(jī)選取6只正常大鼠且不做任何手術(shù);骨癌痛模型組(Cancer-induced bone pain,CIBP組):構(gòu)建骨癌痛模型后,鞘內(nèi)不注入任何藥物;

11、CIBP+生理鹽水組(Normal Saline,NS組):構(gòu)建骨癌痛模型后,鞘內(nèi)注入生理鹽水10 μL;CIBP+二甲基亞砜組(Dimethylsulfoxide,DMSO組):構(gòu)建骨癌痛模型后,鞘內(nèi)注入DMSO10 μL;CIBP+GF109203X(GF109203X組):構(gòu)建骨癌痛模型后,鞘內(nèi)注入PKCγ抑制劑GF109203X 10 μL。觀察各組大鼠注藥前及鞘內(nèi)注藥后15、30、45、60、75 min時(shí)的疼痛行為學(xué)變化(包

12、括機(jī)械縮爪閾值和機(jī)械縮爪持續(xù)時(shí)間);各組大鼠分別在疼痛觀察結(jié)束后取脊髓L4~6節(jié)段組織,采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)各組大鼠腰段脊髓背角PKCγ的表達(dá)變化,探討PKCγ在骨癌痛發(fā)病機(jī)制中的作用。
   3. 大鼠PKCγ基因shRNA慢病毒載體的構(gòu)建及其干擾效率的鑒定方法:根據(jù)PKCγ-mRNA序列,選擇3條19nt的靶序列,設(shè)計(jì)并合成包含正、反義靶序列的互補(bǔ)DNA鏈,退火后插入到pLVTHM載體的H1啟動(dòng)子后獲得重組質(zhì)粒(pLV-

13、PKC1、pLV-PKC2、pLV-PKC3),同時(shí)構(gòu)建一個(gè)非特異性對(duì)照質(zhì)粒(pLV-Con)。將所構(gòu)建的質(zhì)粒與質(zhì)粒pMDLg-pRRE、pRsv-REV、pMD2G共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,包裝產(chǎn)生慢病毒,再將成功包裝的慢病毒分別感染培養(yǎng)的C6細(xì)胞,經(jīng)免疫印跡技術(shù)(Western blot)檢測(cè)PKCγ基因的蛋白表達(dá)水平以評(píng)價(jià)慢病毒載體的抑制效率。結(jié)果:測(cè)序證實(shí)成功構(gòu)建了三個(gè)大鼠PKCγ基因shRNA慢病毒載體,在分別感染C6細(xì)胞后,慢病毒

14、pLV-PKC2、pLV-PKC3可明顯抑制PKCγ蛋白的表達(dá)水平,其中以慢病毒pLV-PKC2 (靶向+1913-+1931位點(diǎn))的抑制效率最高。
   4. 鞘內(nèi)給予PKCγ-shRNA慢病毒載體對(duì)骨癌痛大鼠痛覺(jué)的影響方法:選取24只成年雌性Wistar大鼠制作骨癌痛模型,術(shù)后第7天經(jīng)鞘內(nèi)置管后將模型大鼠隨機(jī)分為4組:CIBP組(鞘內(nèi)不注入任何藥物)、PBS組(鞘內(nèi)注入10μl PBS)、pLV-Con組(鞘內(nèi)注入10μl

15、慢病毒pLV-Con)和pLV-PKC2組(鞘內(nèi)注入10μl 慢病毒pLV-PKC2)。于模型制作前,以及模型制作后每隔3天分別測(cè)定大鼠機(jī)械縮爪閾值和縮爪持續(xù)時(shí)間;各組大鼠在疼痛觀察結(jié)束后取脊髓L4~6節(jié)段組織,采用免疫組織化學(xué)方法、Western blot方法,檢測(cè)各組大鼠腰段脊髓背角PKCγ的表達(dá)變化,探討慢病毒載體pLV-PKC2在在體水平能否特異、有效地抑制大鼠PKCγ基因的表達(dá),從而發(fā)揮其對(duì)骨癌痛大鼠的鎮(zhèn)痛效應(yīng)。
  

16、 5. 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用SPSS 11.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,機(jī)械縮爪閾值和機(jī)械縮爪持續(xù)時(shí)間采用重復(fù)變量數(shù)據(jù)的方差分析,其余結(jié)果比較采用單因素方差分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
   研究總結(jié)
   一、主要研究結(jié)果
   1.本研究通過(guò)疼痛行為學(xué)觀察和免疫學(xué)檢測(cè)表明,骨癌痛模型大鼠復(fù)制成功后,其脊髓背角PKCγ的表達(dá)量顯著增加,且與疼痛程度的改變之間具有明顯的正相關(guān)關(guān)

17、系。
   2.骨癌痛大鼠鞘內(nèi)注射PKCγ抑制劑GF109203X后,PKCγ的功能被抑制并產(chǎn)生了顯著的鎮(zhèn)痛效應(yīng),說(shuō)明PKCγ在骨癌痛的產(chǎn)生和/或維持中發(fā)揮了重要的作用。
   3.根據(jù)PKCγ基因mRNA序列,設(shè)計(jì)并成功構(gòu)建出3個(gè)大鼠PKCγ基因shRNA慢病毒載體,其中慢病毒載體pLV-PKC2能在蛋白水平上特異、高效地抑制PKCγ基因的表達(dá)。
   4.骨癌痛大鼠鞘內(nèi)注射慢病毒pLV-PKC2后,其脊

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