纖維蛋白溶解酶的發(fā)酵制備、分離純化及酶學(xué)性質(zhì)研究.pdf

1、微生物種類繁多、分布廣泛，從自然界中篩選纖維蛋白溶解酶產(chǎn)生菌，進一步開發(fā)高效、特異、安全、廉價的新型溶栓藥物具有巨大的社會價值和經(jīng)濟價值。本文從蝦醬中分離、篩選出一株纖維蛋白溶解酶產(chǎn)生菌，經(jīng)纖維蛋白平板檢測，表現(xiàn)較強的溶栓效果，并對其進行生理生化性質(zhì)鑒定，結(jié)合16S rDNA序列分析，經(jīng)中國典型培養(yǎng)物保藏中心(China Center for Type Culture Collection，CCTCC)鑒定為芽孢桿菌，定命名為Bacil

2、lus sp. nov. SK006(CCTCC NO.:M205071)。
　　 本文在搖瓶水平上對該菌發(fā)酵產(chǎn)酶的培養(yǎng)基組成進行了優(yōu)化，并當(dāng)以葡萄糖為碳源，濃度為2%，胰蛋白胨為氮源，濃度為3%，Na2HPO4·12H2O1.5%、NaH2PO4·2H2O0.13%、MgSO4·7H2O0.05%、CaCl20.01%，初始pH7.0，種齡為18 h，裝液量為50mL/250 mL，接種量為3%，37℃、180 r/min。<

3、br>　　 進一步使用5L全自動發(fā)酵罐對發(fā)酵過程的溫度、pH和通氣量變化對產(chǎn)酶的影響進行了研究，確定了階段變溫策略：0-36 h控制在37℃培養(yǎng)，36 h后至發(fā)酵過程結(jié)束控制在30℃；階段調(diào)整通氣量策略：在菌體的對數(shù)生長期，適當(dāng)加大通氣量有利于細胞的積累從而提高酶的產(chǎn)量。
　　 在5L發(fā)酵罐研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，構(gòu)建BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型來模擬Bacillus sp.nov。SK006發(fā)酵生產(chǎn)纖維蛋白溶解酶過程，對發(fā)酵過程的生物量和纖維

4、蛋白溶解酶的產(chǎn)量進行初步擬合、預(yù)測，結(jié)果表明，BP網(wǎng)絡(luò)模型對纖維蛋白溶解酶的預(yù)測非常具有參考價值。
　　 通過Native-PAGE對Bacillus sp. nov. SK006發(fā)酵液進行初步活性鑒定，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液中含有多種具有纖溶活性的同工酶，通過乙醇沉淀、離子交換層析和凝膠過濾層析等一系列分離純化手段，將其中兩種主要的纖維蛋白溶解酶(SPFE-1與SPFE-2)純化至電泳純，并結(jié)合SDS-PAGE和凝膠過濾對酶的純度和分子量

5、進行鑒定，分析結(jié)果表明，這兩種纖維蛋白溶解酶均為單體酶，分子量分別為46.0 kDa和12.3 kDa。
　　 SPFE-1在50℃以下相對穩(wěn)定，在30-40℃保溫4h，相對酶活仍在60%左右，在50℃保溫2h，也能保持60%以上的酶活，而SPFE-2穩(wěn)定性稍差，但在40℃以下保溫2h仍然保持較高的活力，總的說來，SPFE-1和SPFE-2具有較好的耐熱性。
　　 SPFE-1與SPFE-2在比較寬的pH范圍內(nèi)都保持穩(wěn)定

6、，尤其SPFE-2在pH4.0-8.0的范圍內(nèi)穩(wěn)定性較強。
　　 金屬離子和酶抑制劑對酶活的影響研究表明：Mg2+和Co2+對SPFE-1幾乎沒有影響，而Zn2+能增強酶活力，EDTA、Cu2+、Ca2+、Mn2+、Fe3+、Fe2+和Hg2+則分別對酶產(chǎn)生了不同程度的抑制作用，其中以Cu2+，Hg2+抑制作用最為強烈；PMSF和PCMB對SPFE-1的酶活也表現(xiàn)出較為強烈的抑制作用，推測SPFE-1是一種絲氨酸蛋白酶，且活性中

7、心存在半胱氨酸基團。對于SPFE-2來說，Cu2+和Ca2+促進酶活，而Zn2+卻抑制酶活。2-mercaptoethanol對酶活也有抑制作用，推測Zn2+與SPFE-2活性中心催化部位的-S-S-結(jié)合，改變了酶的催化能力。低濃度的EDTA即可完全抑制SPFE-2，說明SPFE-2可能是一種金屬蛋白酶。
　　 SPFE-1與SPFE-2對底物具有高度專一性，它們的最適底物為N-Succ-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA，

8、該底物是枯草桿菌蛋白酶(subtilisin)或胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)的最適底物，也是納豆激酶的最適底物。采用Hanes-Woolf法作圖法，求得它們作用最佳底物的特征常數(shù)分別為Km:0.60/0.51 mmol/L；kcat:712.93/154.25S-1； kcat/Km:1.19×106/3.02×105 L·s-1 mol-1(SPFE-1/SPFE-2)。
　　 SPFE-1與SPFE-2都既可以直

9、接降解纖維蛋白，還對纖維蛋白溶解酶原有激活作用，從而間接降解纖維蛋白。
　　 在對纖維蛋白原的降解過程中，SPFE-1最先降解纖維蛋白原的β鏈，然后是α鏈，很難降解γ鏈，而SPFE-2順次降解α、β和γ鏈。
　　 SPFE-1與SPFE-2的N-端氨基酸序列的前13個殘基相同，依次為：AQSVPYEQPHLSQ，雖然與幾種芽孢桿菌來源的纖維蛋白溶解酶有一定程度的同源性，但不完全相同于現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的纖維蛋白溶解酶。