豆豉溶栓酶的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)研究.pdf

1、豆豉是我國(guó)傳統(tǒng)的藥食兩用資源，溶栓酶是其中重要的生理活性物質(zhì)。本研究首先對(duì)14種豆豉產(chǎn)品的溶栓活性進(jìn)行比較，然后對(duì)細(xì)菌型豆豉的代表產(chǎn)品——山東臨沂豆豉(半成品)進(jìn)行深入研究。探索了豆豉溶栓酶的分離純化條件；確定了纖維蛋白平板法與水解酪蛋白法測(cè)定溶栓酶酶活的相關(guān)性；最后通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)證實(shí)了溶栓酶在體內(nèi)、外的溶栓作用。主要試驗(yàn)結(jié)果如下： 1.利用纖維蛋白平板法對(duì)14種傳統(tǒng)豆豉產(chǎn)品的溶栓活性物質(zhì)進(jìn)行研究。結(jié)果表明，豆豉提取物的溶栓活性范

2、圍為0.326～161.972尿激酶單位/mL。永川毛霉型豆豉提取物表現(xiàn)出的活性最大，達(dá)161.972尿激酶單位/mL，曲霉豆豉與辣豆豉活性較小。 2.豆豉溶栓酶的分離純化試驗(yàn)首先確定了硫酸銨沉淀豆豉溶栓酶飽和度為75％，其純化倍數(shù)為6.56倍，回收率61.69％；不同離子交換劑對(duì)溶栓酶的吸附效果不同，在所選的兩種離子交換劑中，DEAE-SepharoseFF陰離子交換層析更適合于溶栓酶的分離純化，得到純化倍數(shù)為9.87倍的豆豉

3、溶栓酶酶液，回收率為35.6％；最后經(jīng)過(guò)SephadexG-75凝膠過(guò)濾，得到較純的豆豉溶栓酶，最終純化倍數(shù)為11.29倍，回收率為6.55％。SDS-PAGE凝膠電泳顯示，經(jīng)純化后的酶無(wú)雜蛋白，初步鑒定其分子量接近31KD。 3.豆豉溶栓酶酶學(xué)性質(zhì)建立了一種更為簡(jiǎn)便直觀的測(cè)定方法——水解酪蛋白法，并用該法測(cè)定豆豉溶栓酶的酶學(xué)性質(zhì)，該酶最適作用溫度為60℃，pH7～8時(shí)酶活性最高。豆豉溶栓酶在pH6～10的范圍內(nèi)穩(wěn)定性較強(qiáng)，在2

4、5℃和37℃下，酶在4h內(nèi)基本沒(méi)有活性損失。高于45℃時(shí)酶活下降很快，60℃、0.5h酶活基本喪失。由試驗(yàn)結(jié)果看出，該酶沒(méi)有明顯的金屬離子激活劑，高濃度的Cu2+、Fe3+、Al3+對(duì)酶有抑制作用；添加蛋白胨、明膠可以提高酶的活性。抑制劑PMSF對(duì)豆豉溶栓酶抑制率幾乎達(dá)到100％，EDTA、β-巰基乙醇對(duì)酶活幾乎無(wú)抑制作用。 4.動(dòng)物試驗(yàn)豆豉溶栓酶對(duì)血塊的體外溶解試驗(yàn)結(jié)果表明：豆豉溶栓酶高、低劑量組對(duì)血塊的溶解率均明顯高于對(duì)照組

5、(P均為0.000)，并且隨劑量的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，豆豉溶栓酶對(duì)血塊的溶解作用更為顯著。 豆豉溶栓酶對(duì)小鼠尾靜脈血栓形成的預(yù)防試驗(yàn)表明：豆豉溶栓酶大、小劑量組(分別為1000、500U/kg)均能夠減小血栓形成率及血栓平均長(zhǎng)度，對(duì)血栓形成有一定的預(yù)防作用，并隨劑量的增大抑制血栓形成的作用增強(qiáng)，具有量效關(guān)系。 豆豉溶栓酶對(duì)小鼠肺血栓形成的影響，試驗(yàn)結(jié)果為：大劑量(3000U/kg)的豆豉溶栓酶能減少小鼠癱瘓或死亡數(shù)，對(duì)