纖溶酶高產(chǎn)菌株的分離篩選、發(fā)酵產(chǎn)酶及酶學(xué)性質(zhì)的研究.pdf

1、血栓性疾病是目前臨床上死亡率最高的疾病，尋找高效、安全的溶血栓藥物一直是世界醫(yī)藥行業(yè)關(guān)注的熱點(diǎn)。溶栓療法是血栓性疾病安全且有效的治療手段。目前臨床使用的溶栓藥物主要是纖溶酶原激活劑類，盡管這些藥物的療效肯定，但還存在許多缺陷，而且價(jià)格昂貴。因此研制高效、快速、副作用小、價(jià)廉的新型溶栓藥物的需求迫切。微生物是獲得溶栓劑的重要來源。 本文以脫脂奶粉作為初篩底物，以自制纖維蛋白作為復(fù)篩底物，從保定某屠宰廠附近的土壤中篩得一高產(chǎn)菌株ZL

2、W-2。在此篩選過程中，建立了一套簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的纖溶酶高產(chǎn)菌株篩選方法。經(jīng)菌落形態(tài)和菌體形態(tài)觀察、芽孢的電子顯微鏡觀察以及生理生化鑒定，初步鑒定為芽孢桿菌屬。通過血平板試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)菌株ZLW-2沒有產(chǎn)生溶血現(xiàn)象，說明此菌株的安全性較高。對(duì)其進(jìn)行菌種傳代產(chǎn)酶穩(wěn)定性試驗(yàn)，結(jié)果證明菌株ZLW-2產(chǎn)酶性能穩(wěn)定，傳代10次，酶活力均在165.82U/mL左右。 提出了一種快速、客觀的纖溶酶活力測(cè)定程序。對(duì)于纖溶酶活的測(cè)定方法，國(guó)內(nèi)外學(xué)者使

3、用最多的是纖維蛋白平板法。纖維蛋白平板法最直接，但周期較長(zhǎng)，而且由于制備平板時(shí)所用的試劑或尿激酶標(biāo)準(zhǔn)品不同，所得的結(jié)果可比性差。本試驗(yàn)采用改進(jìn)的紫外分光光度法測(cè)酶活，提高了測(cè)定酶活力的精確性，對(duì)提高纖溶酶產(chǎn)生菌的篩選效率有重要意義。 在搖瓶發(fā)酵水平上，對(duì)芽孢桿菌ZLW-2的發(fā)酵產(chǎn)酶條件進(jìn)行了研究，確定了其最佳培養(yǎng)基成分及最佳培養(yǎng)條件。研究了不同碳源、氮源、磷酸鹽、金屬離子、表面活性劑等因素對(duì)芽孢桿菌ZLW-2產(chǎn)酶的影響，發(fā)現(xiàn)可溶

4、性淀粉、蛋白胨、磷酸二氫鈉濃度對(duì)產(chǎn)酶的影響較大。對(duì)可溶性淀粉、蛋白胨、磷酸二氫鈉三因素各選取三個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，確定芽孢桿菌ZLW-2產(chǎn)酶的最佳培養(yǎng)基成分為：可溶性淀粉7.0％、蛋白胨7.0％、磷酸二氫鈉1.5％、硫酸鎂0.01％、CaCl<,2> 10 μmol/L。通過搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)，確定其最佳培養(yǎng)條件為：搖床32℃，225 r/min，發(fā)酵培養(yǎng)基的起始pH值為8.0，接種量為2％，裝液量為40 mL/300 mL，培養(yǎng)52 h。經(jīng)

5、過發(fā)酵工藝優(yōu)化，芽孢桿菌ZLW-2的產(chǎn)酶活力可達(dá)547.95 U/mL，是優(yōu)化前酶活力的3.13倍。 酶學(xué)性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌ZLW-2的基本酶學(xué)性質(zhì)為：最適溫度為50℃，70℃保溫60 min，酶活力仍有11％。最適pH值為8.0。該酶在偏堿pH 7.0～8.0環(huán)境下較穩(wěn)定。在4℃環(huán)境中放置30 d后，酶活力仍有91％；在-20℃冰箱凍藏，30 d酶的殘余酶活力仍有83％。金屬離子中，pb<'2+>、Mn<'2+>對(duì)纖溶酶有