中藥清毒栓對HPV相關(guān)宮頸癌防治的實驗研究.pdf

1、目的 通過研究中藥清毒栓含藥血清對人宮頸癌SiHa細胞體外增殖、細胞周期及凋亡的影響以及其對MDM2基因和p53基因表達的影響，從細胞及分子生物學水平探討清毒栓防治宮頸癌的作用機制。 方法 1．含藥血清的提取：參照李儀奎法提取含藥血清，56℃水浴滅活后分裝，-70℃冰箱保存?zhèn)溆茫?2．體外生長抑制實驗：以不同濃度含藥血清培養(yǎng)液分別作用于SiHa細胞24、48、72、96h，并設(shè)立空白血清及含中、西藥陽性對

2、照藥血清為對照組，通過MTT法檢測該藥對細胞生長及增殖的影響，計算抑制率并選出最佳量效時點以進行下一步實驗； 3．細胞周期及細胞凋亡實驗：用流式細胞分析技術(shù)進行細胞周期及細胞調(diào)亡檢測，根據(jù)MTT的最佳量效時點條件的藥血清培養(yǎng)液處理SiHa細胞后，用RNAase消化半小時，PⅠ避光染色1小時，上機檢測，Modi Fit軟件進行細胞周期分析并繪制DNA分布圖，同時設(shè)立空白血清及含中、西藥陽性對照藥血清為對照組； 4．用PT—

3、PCR法半定量檢測對原癌基因MDM2及抑癌基因p53mRNA表達的影響：根據(jù)MTT的最佳量效時點條件的含藥血清培養(yǎng)液處理SiHa細胞后，提取總RNA，進行RT—PCR反應(yīng)后，電泳、凝膠圖像分析儀采集圖像，分析灰度值，同時設(shè)立空白血清及含中、西藥陽性對照藥血清為對照組。 結(jié)果: 1．清毒栓含藥血清對SiHa細胞體外增殖有明顯的抑制作用，并隨著血清濃度的增加其抑制作用更加明顯，在一定濃度范圍內(nèi)呈劑量依賴性?？诜M清毒栓含藥血

4、清與其它對照組相比72h時對SiHa細胞抑制作用最強，96h抑制作用明顯減弱，陰道給藥組各含藥血清組與空白血清對照組比較對細胞也有明顯的抑制作用。 2．細胞周期及細胞凋亡的研究： 2.1 細胞周期各時相中，口服給藥各含藥血清組(G<,0>-G<,1>期所占比例較空白血清對照組增加，其差異有顯著性(P<0.01)。而口服各組含藥血清組S期所占比例較空白血清對照組減少，其差異有顯著性(P<0.05)，尤以干擾素組明顯(P<0

5、.01)，清毒栓組次之。而陰道給藥各含藥血清組與空白血清對照組比較在G<,0>-G<,1>期所占比例有增加的趨勢； 2.2 口服給藥組清毒栓組及干擾素組含藥血清對細胞凋亡有促進作用，與空白血清對照組相比有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；保婦康組含藥血清未見明顯差異，陰道給藥各含藥血清組與空白血清對照組比較在細胞凋亡方面未見明顯差異。 3．MDM2-p53基因反饋環(huán)表達： 3.1 對MDM2基因表達的影響：經(jīng)RT—PC

6、R并測定電泳條帶吸光度值，計算MDM2與β<,2m>基因擴增片段的吸光度比值，可見各組含藥血清與空白對照組相比，MDM2mRNA的表達量降低(P<0.01)，以干擾素組最佳，清毒栓次之，清毒栓與干擾素組相比較無顯著性差異。 3.2 對p53基因表達的影響：經(jīng)RT—PCR并測定電泳條帶吸光度值，計算p53與β<,2m>基因擴增片段的吸光度比值，可見各組含藥血清與空白對照組相比，p53 mRNA的表達量增加(P<0.01)，以干擾素