化合物抑制體內(nèi)外巨噬細(xì)胞活化釋放HMGB1及其機(jī)制研究.pdf

1、乙型肝炎病毒能引起人類乙型病毒性肝炎，采取早期干預(yù)措施減輕肝炎，對(duì)于降低“病死率”具有重要意義。巨噬細(xì)胞通過(guò)釋放促炎細(xì)胞因子在炎癥中起著重要作用。高遷移率族蛋白1(HMGB1)以主動(dòng)方式從活化巨噬細(xì)胞釋放出去，是一個(gè)重要晚期致炎因子。
　　本課題旨在用LPS活化巨噬細(xì)胞體外模型篩選較優(yōu)抗炎化合物，進(jìn)一步研究其抗炎作用是否與HMGB1有關(guān)并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行探析。
　　本論文分為以下四個(gè)部分:
　　第一部分較優(yōu)抗炎化合物的篩選

2、
　　目的：從40種化合物中體外篩選較優(yōu)抗炎化合物。
　　方法：RAW264.7細(xì)胞經(jīng)不同濃度的LPS和/或化合物處理24小時(shí)后，用ELISA或Griess法檢測(cè)上清液中NO、TNF-α和/或IL-6等指標(biāo)水平，確定LPS劑量并篩選較優(yōu)抗炎化合物。
　　結(jié)果：1、在合適LPS劑量范圍內(nèi)，暴露于LPS的RAW264.7細(xì)胞中NO、TNF-α和IL-6顯著升高，且呈劑量依賴性。2、篩選出白藜蘆醇(Res)和紫草素(Shik

3、)等7種較優(yōu)抗炎化合物，均能顯著下調(diào)NO和TNF-α表達(dá)。3、Res和Shik劑量依賴地下調(diào)NO和TNF-α表達(dá)。
　　結(jié)論：1、篩選出7種較優(yōu)抗炎化合物;2、Res和Shik具有較好劑量依賴抗炎效果。
　　第二部分白藜蘆醇(Res)減輕炎癥作用并減少RAW264.7細(xì)胞中LPS誘導(dǎo)的HMGB1和TLR4的表達(dá)。
　　目的：研究Res抗炎作用及機(jī)制。
　　方法：暴露于不同劑量LPS24小時(shí)的RAW264.7細(xì)胞，

4、同時(shí)經(jīng)Res或不經(jīng)Res處理后用ELASA或Griess法測(cè)定上清液中TNF-α、IL-6、NO水平，并用qRT-PCR及Western Blot試驗(yàn)檢測(cè)HMGB1和TLR4表達(dá)。
　　結(jié)果：1、Res顯著減少IL-6，NO和TNF-α表達(dá)。2、Res顯著減少HMGB1和TLR4表達(dá)。
　　結(jié)論：1、Res能阻斷LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞的炎癥效應(yīng)。2、HMGB1表達(dá)下調(diào)是Res的作用機(jī)制之一。3、Res也可影響HMGB

5、1-TLR4信號(hào)通路。
　　第三部分紫草素(Shik)通過(guò)IFN-β和NF-κB信號(hào)通路抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞HMGB1的釋放。
　　目的：研究Shik的抗炎作用及機(jī)制。
　　方法：暴露于不同劑量LPS24小時(shí)的RAW264.7細(xì)胞，同時(shí)經(jīng)Shik或不經(jīng)Shik處理后用ELISA或Griess法測(cè)定上清液中TNF-α、IL-6、NO水平，并用qRT-PCR、ELISA或Western Blot試驗(yàn)檢測(cè)HM

6、GB1、IFN-β和細(xì)胞核對(duì)細(xì)胞質(zhì)NF-κB比率表達(dá)。
　　結(jié)果：1、Shik能顯著減少IL-6，NO和TNF-α表達(dá)。2、Shik顯著減少LPS組HMGB1、IFN-β表達(dá)和細(xì)胞核對(duì)細(xì)胞質(zhì)NF-κB蛋白表達(dá)比率。3、IFN-β信號(hào)分子JAK和NF-κB抑制劑顯著減少HMGB1表達(dá)。
　　結(jié)論:1、Shik拮抗LPS引起RAW264.7細(xì)胞炎癥應(yīng)答;2、下調(diào)HMGB1表達(dá)是Shik抗炎機(jī)制之一，這與IFN-β和NF-κB信號(hào)

7、通路有關(guān)。
　　第四部分白藜蘆醇(Res)和紫草素(Shik)通過(guò)調(diào)節(jié)HMGB1發(fā)揮抗炎作用的體內(nèi)研究
　　目的：研究Res和Shik在肝衰竭小鼠抗炎作用。
　　方法：用H&E染色觀察半乳糖胺(GalN)/LPS急性肝衰竭小鼠肝損傷情況，檢測(cè)血清ALT/AST，和用ELISA檢測(cè)HMGB1水平。
　　結(jié)果：1、GalN/LPS組ALT/AST顯著升高，且肝損傷明顯。2、與模型組相比，Res治療組ALT/AST未顯