煙堿型受體α7亞型在小鼠皮膚損傷愈合過程中調(diào)控作用研究.pdf

1、目的:
　　乙酰膽堿(ACh)可由皮膚內(nèi)的角質(zhì)形成細胞、內(nèi)皮細胞和各種免疫細胞分泌，有調(diào)控細胞增殖、分化、凋亡、黏附和遷移的功能，在創(chuàng)口愈合中起重要作用?，F(xiàn)有研究認為，乙酰膽堿N型受體(nAChR)被激活后，對創(chuàng)口愈合的作用存在矛盾，有些研究認為有促進作用，而有些研究則認為起抑制作用。主要有兩種理論對這種矛盾現(xiàn)象進行解釋:一種認為激動劑的長期給藥抑制創(chuàng)口愈合，短期促進愈合，另一種認為低劑量給藥促進愈合，高劑量則抑制愈合。
　

2、　Jacobi、Morimoto和Liem發(fā)現(xiàn)，nAChR被煙堿激活后，通過促進血管形成作用促進小鼠皮膚缺損性創(chuàng)口的愈合。因Jacobi使用的煙堿劑量比Morimoto和Liem的劑量小1000倍，而促進血管形成作用明確的堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)的用量差異卻不大，提示除了促進血管形成作用以外，nAChR還能通過其他機制影響創(chuàng)口愈合。三人使用的動物模型都有炎性反應程度較重的特點，不能排除nAChR通過抗炎作用促進創(chuàng)口愈合的可能性

3、。
　　研究表明，對炎性反應程度重的創(chuàng)口進行抗炎可促進創(chuàng)口愈合，而對炎性反應程度輕的創(chuàng)口抗炎則可能起相反作用。與未覆蓋創(chuàng)口相比，透明傷口敷料覆蓋創(chuàng)口的炎性反應程度較低。如果同一種nAChR激動劑對這兩類創(chuàng)口產(chǎn)生了不同影響，則提示抗炎作用與nAChR對創(chuàng)口愈合的矛盾影響有關。
　　nAChR的抗炎作用和促進血管形成作用主要由α7nAChR介導，故使用α7nAChR的特異性激動劑對兩類創(chuàng)口愈合的影響進行比較性研究，應有助于闡明n

4、AChR對創(chuàng)口愈合矛盾影響的機制。α7nAChR還有促進角質(zhì)形成細胞定向遷移，控制表皮穩(wěn)態(tài)，促進角質(zhì)形成細胞終末分化，促進多種癌細胞發(fā)生上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的作用，也可能通過這些機制影響創(chuàng)口愈合。
　　另外，損傷時間推斷是法醫(yī)學研究的一個重要課題，而創(chuàng)口類型、吸煙、縫合、包扎及抗炎治療等因素均可能影響推斷的準確性。使用α7nAChR的特異性激動劑對未覆蓋與覆蓋創(chuàng)口愈合的影響進行比較性研究，有助于找到比較穩(wěn)健的指標，并探討損傷時

5、間推斷中需注意的事項。
　　方法:
　　選用8周齡清潔級BALB/c小鼠，雄性，體重18-26g。使用直徑為4mm的角膜環(huán)鉆，以小鼠背部脊柱最高點兩側1cm處為中心，切除兩側全層皮膚。用透明傷口敷料（TegadermTM，1624W型，3M公司）1/4張貼敷在手術區(qū)域皮膚，建立炎性反應程度輕的覆蓋創(chuàng)口模型。先粘貼透明傷口敷料，再將皮膚切除，建立常規(guī)炎性反應程度的未覆蓋創(chuàng)口模型。
　　選擇α7nAChR特異性激動劑PNU

6、-282987為干預因素。預實驗中，每組每個時段5只小鼠（剔除感染、死亡小鼠后）。麻醉前10min，實驗組腹腔注射0.1mg/ml PNU-282987（Ea組）、0.01mg/ml PNU-282987(Eb組)和0.001mg/ml PNU-282987（Ec組）生理鹽水溶液10ml/kg，對照組（C組）腹腔注射10ml/kg生理鹽水。每24h給藥一次，處死當天不給藥。每組于造模后1d、3d、5d、7d腹腔注射過量戊巴比妥鈉處死，體

7、視顯微照相觀察創(chuàng)口形態(tài)。經(jīng)過統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，1mg/kg PNU-282987在傷后7天時明顯抑制創(chuàng)口再上皮化，故選用此劑量為正式實驗劑量。
　　對α7nAChR激活后對炎性反應程度不同創(chuàng)口愈合影響進行比較性研究時，按照處理因素不同隨機分為4組:未覆蓋實驗組（E1組）、未覆蓋對照組（C1組）、覆蓋實驗組（E2組）和覆蓋對照組（C2組），每組每個時段5只小鼠（剔除感染、死亡小鼠后）。將E1組和E2組合稱為實驗組，將C1組和C2組合稱為

8、對照組，將C1組和E1組合稱為未覆蓋組，將C2組和E2組合稱為覆蓋組。麻醉前10min，實驗組腹腔注射0.1mg/mlPNU-282987生理鹽水溶液10ml/kg，對照組腹腔注射生理鹽水10ml/kg。每24h給藥一次，處死當天不給藥。每組于造模后1d、3d、5d、7d、10d腹腔注射過量戊巴比妥鈉處死。在剔除感染、死亡的小鼠后，每組每個時段5只小鼠。創(chuàng)口周圍取1.5cm×1.5cm皮膚為檢材，左側進行形態(tài)學檢測，右側用于蛋白含量測定

9、。使用HE染色和免疫組化染色方法進行形態(tài)學檢測，使用酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)進行蛋白含量測定。
　　培養(yǎng)HaCaT細胞，在培養(yǎng)基內(nèi)加入生理鹽水或等量不同濃度的PNU-282987生理鹽水溶液，使培養(yǎng)基內(nèi)PNU-282987濃度分別達到10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml、0.01μg/ml和0.001μg/ml。觀察細胞形態(tài)變化，測量E鈣黏蛋白含量、劃痕愈合速度和細胞增殖率。
　　使用GraphPad Pr

10、ism軟件進行統(tǒng)計分析，所有直方圖中數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示，所有折線圖中數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準誤表示。未覆蓋組和覆蓋組、實驗組和對照組間比較采用雙因素方差分析，覆蓋實驗組和覆蓋對照組、未覆蓋實驗組和未覆蓋對照組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果:
　　α7nAChR激活后，可影響某些時段某類創(chuàng)口炎細胞的浸潤和炎性細胞因子的表達，未覆蓋和覆蓋創(chuàng)口的這兩項指標也存在差異。傷后1天時，覆蓋實驗組巨噬細胞數(shù)高于覆

11、蓋對照組，未覆蓋組中性粒細胞數(shù)、巨噬細胞數(shù)和IL-6含量高于覆蓋組。傷后3天時，實驗組、未覆蓋實驗組和覆蓋實驗組中性粒細胞數(shù)分別低于對照組、未覆蓋對照組和覆蓋對照組，實驗組和覆蓋實驗組IL-6含量分別低于對照組和覆蓋對照組，未覆蓋實驗組HMGB1含量低于未覆蓋對照組，未覆蓋組中性粒細胞和巨噬細胞數(shù)高于覆蓋組。傷后5天時，未覆蓋實驗組和未覆蓋組中性粒細胞數(shù)分別少于未覆蓋對照組和覆蓋組，未覆蓋組巨噬細胞數(shù)、TNFα和HMGB1含量多于覆蓋組

12、。傷后7天時，未覆蓋組巨噬細胞數(shù)和HMGB1含量高于覆蓋組。傷后10天時，實驗組和未覆蓋實驗組IL-6、IL-1β和TNFα含量分別低于對照組和未覆蓋對照組，未覆蓋組巨噬細胞數(shù)、HMGB1含量、IL-1β含量和TNFα含量高于覆蓋組。α7nAChR激活后，促進未覆蓋和覆蓋創(chuàng)口傷后早期再上皮化，促進未覆蓋創(chuàng)口傷后晚期再上皮化，抑制覆蓋創(chuàng)口傷后晚期角質(zhì)形成細胞增殖，促進新生表皮翹起和脫落，抑制再上皮化;抑制未覆蓋創(chuàng)口傷后晚期EGF表達，促進

13、晚期再上皮化。覆蓋創(chuàng)口的創(chuàng)緣表皮壞死長度較短，再上皮化減慢，傷后晚期角質(zhì)形成細胞增減弱，EGF和KGF含量降低。傷后1天時，未覆蓋組創(chuàng)緣真皮層內(nèi)大量中性粒細胞浸潤，創(chuàng)緣壞死表皮長度大于覆蓋組。傷后3天時，實驗組和未覆蓋組再上皮化比例分別高于對照組和覆蓋組。傷后5天時，未覆蓋組再上皮化比例高于覆蓋組。傷后7天時，覆蓋實驗組和覆蓋組再上皮化比例和新生表皮內(nèi)增殖細胞數(shù)分別低于覆蓋對照組和未覆蓋組，未覆蓋實驗組再上皮化比例高于未覆蓋對照組。傷后

14、10天時，覆蓋實驗組新生表皮發(fā)生翹起或脫落，再上皮化比例低于覆蓋對照組，未覆蓋實驗組EGF含量低于未覆蓋對照組，未覆蓋組再上皮化比例、EGF含量和KGF含量高于覆蓋組。α7nAChR激活后，促進未覆蓋創(chuàng)口肉芽組織和血管形成，抑制覆蓋創(chuàng)口傷后早期血管形成;對某些時段某類創(chuàng)口bFGF和VEGF表達有影響。傷后1天時，未覆蓋組bFGF含量高于覆蓋組。傷后3天時，新生血管主要出現(xiàn)于皮肌層斷端周圍和創(chuàng)緣真皮層內(nèi)，覆蓋實驗組和覆蓋組新生血管數(shù)分別少

15、于覆蓋對照組和覆蓋組。傷后5天時，新生血管開始在肉芽組織內(nèi)出現(xiàn)，未覆蓋實驗組新生血管數(shù)高于未覆蓋對照組，未覆蓋實驗組VEGF含量低于未覆蓋對照組，未覆蓋組新生血管數(shù)、肉芽組織面積和VEGF含量高于覆蓋組。傷后7天時，實驗組和覆蓋實驗組VEGF含量分別低于對照組和覆蓋對照組，未覆蓋實驗組和未覆蓋組新生血管數(shù)和肉芽組織面積分別高于未覆蓋對照組和覆蓋組。傷后10天時，實驗組和未覆蓋實驗組VEGF含量分別低于對照組和未覆蓋對照組，未覆蓋實驗組新

16、生血管數(shù)高于未覆蓋對照組，未覆蓋組新生血管數(shù)和VEGF含量高于覆蓋組。α7nAChR激活后，對HaCaT細胞劃痕愈合、細胞增殖和E鈣黏蛋白表達無明顯影響。
　　結論:
　　1.α7nAChR激活后，對未覆蓋和覆蓋創(chuàng)口愈合的影響不同。對未覆蓋創(chuàng)口有促進再上皮化，促進肉芽組織和血管形成的作用;對覆蓋創(chuàng)口有促進早期再上皮化，抑制早期血管形成，抑制晚期再上皮化作用。
　　2.α7nAChR激活后，其促進血管形成作用是條件性的，

17、需要一定程度的炎性反應為基礎，而促進血管形成作用可能并非促進再上皮化的重要機制。
　　3.α7nAChR激活后，促進未覆蓋和覆蓋創(chuàng)口早期再上皮化，促進未覆蓋創(chuàng)口晚期再上皮化，與抗炎作用和促進角質(zhì)形成細胞遷移作用有關。抑制覆蓋創(chuàng)口晚期再上皮化，與促進角質(zhì)形成細胞終末分化、凋亡作用有關。促進未覆蓋創(chuàng)口肉芽組織形成，與抗炎和促進血管形成作用有關。
　　4.α7nAChR激活后，對炎性反應程度不同創(chuàng)口愈合的矛盾影響與抗炎、促進角質(zhì)形