以HBcAg為載體的胃癌疫苗的構(gòu)建、表達、純化及免疫研究.pdf

1、本試驗在以往研究的基礎上，通過基因克隆方法構(gòu)建pET-21A/MIR/MAGE-A3串聯(lián)表位重組質(zhì)粒，探索其在原核表達系統(tǒng)的蛋白表達并鑒定，并將它們合成的蛋白通過細胞免疫和體液免疫兩個方向進行免疫研究。以期能合成用于胃癌臨床試驗的免疫性疫苗。
　　目的:
　　[1]以pET-21a/MIR為載體，構(gòu)建含MAGE-A3串聯(lián)表位基因的重組質(zhì)粒并鑒定;
　　[2]重組質(zhì)粒pET-21a/MIR-MAGE-A3串聯(lián)表位的蛋白表

2、達及鑒定;
　　[3]研究pET-21a/MIR-MAGE-A3串聯(lián)表位蛋白的免疫原性。
　　方法:
　　[1]通過PCR擴增出MAGE-A3表位基因，插入到載體HBc的MIR區(qū)，構(gòu)建3個重組質(zhì)粒即pET21a/HBcAg(MIR)-ozlf-351'、pET21a/HBcAg(MIR)-ozlf-351'/ozlf-352、pET21a/HBcAg(MIR)-ozlf-351'/ozlf-352/ozlf-353(重

3、組質(zhì)粒表達蛋白分別稱為MIR-ozlf-351'、MIR-ozlf(351'+352)、MIR-ozlf(351'+352+353))。經(jīng)PCR鑒定、DNA測序驗證正確后，將3個重組質(zhì)粒及pET21a/HBc(MIR)（質(zhì)粒表達蛋白簡稱MIR）轉(zhuǎn)化入BL21菌株中，IPTG誘導質(zhì)粒的蛋白表達，經(jīng)Ni-NTA層析法純化，然后進行WB檢測鑒定表達蛋白;
　　[2]選取6～8周的BALB/c雌性小鼠，隨機分為6組，分別為CTL合成肽、M

4、IR-ozlf-351'、MIR-ozlf351'/352/353組，PBS和MIR組為陰性對照，全長MAGE-A3表達蛋白組為陽性對照，每組7只。分別在1、3、5w時，皮下多點注射免疫，免疫3次;0w、2w、4w、6w、8w時斷尾取血并分離血清，酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)分別檢測特異性IgG和IgA。末次免疫后2w，用CTL合成肽孵育小鼠脾細胞:以P815細胞為靶細胞，LDH法檢測試劑盒檢測CTL的殺傷活性。
　　結(jié)果:<

5、br>　　[1]成功構(gòu)建了含表位基因的重組質(zhì)粒pET21 a/HBcAg(MIR)-ozlf-351'、pET21 a/HBcAg(MIR)-ozlf-351'/ozlf-352pET21 a/HBcAg(MIR)-ozlf-351/'ozlf-352/ozlf-353,MIR-ozlf-351'、MIR-ozlf(351'+352+353)及MIR蛋白在大腸桿菌BL21中成功表達，WB證實獲得了純化的目的蛋白;
　　[2]免疫原

6、性檢測:
　　體液免疫:ELISA檢測免疫前后各組小鼠血清中目的蛋白特異性IgG抗體水平，用吸光度值來表示。當小鼠血清稀釋度為1∶100時，ELISA結(jié)果顯示:各組小鼠IgG抗體水平隨著免疫次數(shù)的增加，在第4W開始升高，第6W達到高峰。重組蛋白MIR-ozlf-351'組IgG抗體水平(0.433±0.025)較重組蛋白MIR-ozlf-351'/ozl f-352/ozlf-353(0.281±0.029)高，全長蛋白MAGE-

7、A3組IgG抗體水平最高(0.988±0.023)，而重組蛋白MIR-ozlf-351'/ozlf-352/ozlf-353IgG抗體水平相對較低，PBS組為(0.147±0.008)。
　　細胞免疫:LDH法檢測CTL的殺傷靶細胞作用，殺傷率計算結(jié)果顯示:1）各組蛋白在效靶比為40∶1時殺傷率最高;2）效靶比為40∶1和20∶1時，一表位、三表位組的殺傷率相對MAGE-A3組要低;3）效靶比為10∶1時，三表位組殺傷率明顯升高，

8、高于一表位和MAGE-A3組的殺傷率。
　　結(jié)論:
　　[1]成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pET21a/HBcAg(MIR)-ozlf-351'、pET21a/HBcAg(MIR)-ozl f-351'/ozlf-352、 pET21a/HBcAg(MIR)-ozlf-351'/ozlf-352/ozlf-353，原核表達蛋白量尚可;
　　[2] HBcAg(MIR)-MAGE-A3串聯(lián)表位蛋白可誘導小鼠產(chǎn)生MAGE-A3特異性的