犬瘟熱DNA疫苗的構(gòu)建及免疫實(shí)驗(yàn)的研究.pdf

1、犬瘟熱病毒(CDV)屬于副粘病毒科(family Paramyxoviridae)麻疹病毒屬(genus Morbillivirus)成員，為有囊膜的負(fù)鏈線性RNA病毒，自然條件下犬瘟熱病毒感染食肉目中犬科、鼬科、浣熊科等多種動物，貓科動物也可感染。是當(dāng)前對養(yǎng)犬業(yè)、毛皮動物養(yǎng)殖業(yè)和野生動物保護(hù)業(yè)危害最大的疾病之一。 防治犬瘟熱的有效途徑是疫苗接種，雖然滅活疫苗和弱毒疫苗在控制犬瘟熱發(fā)生上起了一定作用，但隨著使用的廣泛，也發(fā)現(xiàn)了許

2、多缺陷，弱毒苗可引起免疫抑制和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損壞；隨著CDV宿主譜日趨擴(kuò)大，弱毒疫苗的使用還可能致死某些易感動物并帶來散毒的危險。此外，CDV本身的變異也可能導(dǎo)致疫病的流行。因此，必須尋找更安全、有效、實(shí)用的新型疫苗?；蛞呙绾椭亟M活載體疫苗是近年來研究比較熱的新型疫苗，在預(yù)防免疫方面也取得很大進(jìn)展。 最新研究表明CDV融合蛋白(F)和血凝素(H)蛋白是宿主免疫系統(tǒng)的主要目的抗原，是產(chǎn)生中和抗體的重要抗原之一。核衣殼(N)蛋白是

3、保守性較強(qiáng)的免疫原性蛋白，此外N蛋白上含有T細(xì)胞表位。H，F(xiàn)和N蛋白在犬瘟熱的免疫預(yù)防方面起重要作用。 為了研制新一代安全、高效的CDV基因工程疫苗，本研究根據(jù)GeneBank己發(fā)表的犬瘟熱病毒H、F和N基因序列，設(shè)計四對特異引物，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增后，連接到pMD18-T載體，序列測定證明各基因序列正確。然后將各基因亞克隆到真核表達(dá)載體pIRESlneo中，構(gòu)建成四種重組真核表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)過Western-blot鑒定證明各重組

4、質(zhì)?？梢员磉_(dá)相應(yīng)的目的蛋白。之后以構(gòu)建的真核表達(dá)質(zhì)粒pIRES H、pIRES F、pIRES Nl和pIRES N2為基因疫苗，進(jìn)行了小鼠和貉子的動物免疫試驗(yàn)，對免疫鼠和貉子體內(nèi)免疫應(yīng)答水平進(jìn)行了ELISA檢測，并對貉子進(jìn)行了攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示：所構(gòu)建的基因疫苗可以誘導(dǎo)小鼠和貉子產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)，雖然貉子在經(jīng)過三次基因免疫后仍不能完全抵抗強(qiáng)度攻擊(保護(hù)率為33％到100％不等)，但弱毒疫苗也有貉子攻毒后死亡，不能對貉子產(chǎn)生完