以Ad41為載體的輪狀病毒疫苗免疫效果初探.pdf

1、A組輪狀病毒（GroupARotavirus，簡(jiǎn)稱ARV）是引起全世界5歲以下嬰幼兒嚴(yán)重腹瀉的首要病原，全世界每年有超過(guò)527，000個(gè)因感染輪狀病毒而死亡的病例，且每年有近兩百萬(wàn)以上兒童因此患重病。鑒于輪狀病毒危害嚴(yán)重且無(wú)有效治療手段，世界衛(wèi)生組織一直將發(fā)展輪狀病毒疫苗列為最優(yōu)發(fā)展疫苗項(xiàng)目之一。
　　 接種RV疫苗被認(rèn)為是減少重癥RV感染、發(fā)病和死亡的最好方法，目前公認(rèn)的最佳免疫方式為口服免疫。腺病毒載體是目前基因治療和重組疫

2、苗中應(yīng)用最廣泛的病毒載體之一。由于腺病毒能在呼吸道和腸道內(nèi)繁殖，所以能誘導(dǎo)全身免疫并產(chǎn)生局部粘膜免疫。另外，腺病毒安全可靠，可以通過(guò)口服或滴鼻給藥，不產(chǎn)生熱源及其它副作用，適于嬰幼兒使用。我們課題組前期以腺病毒為載體表達(dá)輪狀病毒保護(hù)性抗原，對(duì)輪狀病毒基因工程疫苗做了很多系統(tǒng)性的研究工作。我們研究表明，以Ad5為載體，表達(dá)輪狀病毒VP6基因的重組腺病毒在滴鼻的免疫方式上，取得了比較好的免疫和保護(hù)效果。腸腺病毒HAdV-41是天然的人胃腸道

3、病原，是潛在的口服給藥基因轉(zhuǎn)移載體和靶向治療胃腸道載體，已有使用HAdV-41作為疫苗載體的相關(guān)報(bào)道。我們課題組前期已經(jīng)成功構(gòu)建了新型的E1區(qū)缺失的重組Ad41載體系統(tǒng)和能夠促進(jìn)HAdV-41在體外培養(yǎng)和擴(kuò)增的細(xì)胞系293TE7，體外檢測(cè)顯示Ad41對(duì)酸的耐受情況好于Ad5。另外，口服給藥是最簡(jiǎn)單的給藥方式，與腹瀉病毒天然的侵入方式相同，又有同時(shí)激活系統(tǒng)免疫和粘膜免疫的作用。因此，以Ad41為載體，探討口服免疫重組輪狀病毒疫苗的免疫保護(hù)

4、作用具有重要的意義。
　　 基于前期的研究成果，在本研究中，我們利用反向遺傳學(xué)的方法成功構(gòu)建了HAdV-41感染性克隆pKAd41，建立了293TE7-HAdV-41系統(tǒng)，為進(jìn)一步開(kāi)展HAdV-41的生物學(xué)研究打下了基礎(chǔ)，為促進(jìn)Ad41作為口服疫苗載體的研究打下基礎(chǔ)。本研究還成功制備了以Ad41為載體，穩(wěn)定表達(dá)人輪狀病毒VP6基因的非復(fù)制型重組腺病毒rvAd41-VP6(o)，口服免疫小鼠結(jié)果證實(shí)，腸腺病毒載體Ad41作為疫苗載

5、體，比Ad5更適合用于為腹瀉病毒的疫苗研制，為Ad41作為口服疫苗載體的應(yīng)用提供了有利證據(jù)。
　　 一、人腺病毒41型感染性克隆的成功構(gòu)建
　　 目的:構(gòu)建人腺病毒41型感染性克隆，以便進(jìn)一步研究HAdV-41并改良Ad41載體系統(tǒng)。方法和結(jié)果:首先，我們用BglⅡ酶切攜帶GFP基因的重組腺病毒質(zhì)粒pAd41-GFP，回收含有Kan-pBR322Ori和HAdV-41基因組左、右末端的片段，與野生型HAdV-41基因組D

6、NA共電轉(zhuǎn)化大腸桿菌BJ5183菌株發(fā)生同源重組，經(jīng)Kan抗性篩選得到HAdV-41感染性克隆pKAd41，該克隆轉(zhuǎn)染293TE7細(xì)胞成功拯救出野生型HAdV-41病毒;通過(guò)酶切和測(cè)序等方法鑒定拯救的HAdV-41病毒成功整合了穩(wěn)定的基因組DNA;用Westernblot技術(shù)驗(yàn)證了HAdV41病毒含長(zhǎng)短Fiber為41型腺病毒;銀染實(shí)驗(yàn)從蛋白水平證實(shí)HAdV-41具有比較完整的病毒蛋白組分;分別用HAdV-41病毒感染293TE7和29

7、3細(xì)胞，免疫熒光技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Hexon蛋白在293TE7細(xì)胞中的表達(dá)更強(qiáng);HAdV-41病毒在293TE7細(xì)胞中的生長(zhǎng)曲線分析表明，HAdV-41病毒在293TE7細(xì)胞中具有非細(xì)胞溶解復(fù)制特性，并且只有非常少的子代病毒釋放到培養(yǎng)上清中;我們分別以不同MOI的HAdV-41感染293TE7細(xì)胞，觀察細(xì)胞在感染病毒后連續(xù)1～13d的變化，結(jié)果證實(shí)病毒感染細(xì)胞后在長(zhǎng)時(shí)間的復(fù)制增殖過(guò)程中不會(huì)有噬斑的出現(xiàn)。結(jié)論:本部分研究成功構(gòu)建了有效的感染性克

8、隆pKAd41，表明用pKAd41和293TE7細(xì)胞系統(tǒng)來(lái)研究HAdV-41是可取的，為深入研究HAdV-41的生物學(xué)特性打下了基礎(chǔ)，為第二部分利用Ad41作為口服疫苗基因轉(zhuǎn)移載體的研究提供了有用信息。
　　 二、以Ad41為載體的輪狀病毒VP6基因重組腺病毒免疫效果初探
　　 目的:以Ad41為載體，制備和鑒定可表達(dá)A組輪狀病毒VP6基因的非復(fù)制型重組腺病毒，在小鼠模型上觀察粘膜、體液和細(xì)胞免疫效果和攻毒保護(hù)作用，探討

9、腸腺病毒載體Ad41作為疫苗載體，用于腹瀉病毒的疫苗研制的可行性。方法和結(jié)果:我們首先利用本室前期構(gòu)建的重組腺病毒真核表達(dá)載體，PmeⅠ線性化后經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染293TE7細(xì)胞，包裝出重組腺病毒rvAd41-VP6(o);經(jīng)酶切和透射電子顯微鏡技術(shù)鑒定正確后，通過(guò)PCR、RT-PCR技術(shù)證實(shí)rvAd41-VP6(o)中確有特異性的VP6基因穩(wěn)定整合并轉(zhuǎn)錄，有較好的遺傳穩(wěn)定性;通過(guò)Westernblot技術(shù)鑒定目的蛋白的表達(dá)和病毒型特異性

10、，結(jié)果證實(shí)rvAd41-VP6(o)為41型腺病毒，可穩(wěn)定表達(dá)VP6蛋白;大量擴(kuò)增rvAd41-VP6(o)并經(jīng)氯化銫密度梯度離心純化得到足量的重組腺病毒;用消化法和有限稀釋法檢測(cè)滴度，顆粒滴度和感染滴度分別達(dá)到了4.35×1011VP/ml和3.95×108IU/ml;一步法生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)證實(shí)了rvAd41-VP6(o)具備病毒復(fù)制生長(zhǎng)的基本特征，病毒在細(xì)胞中具有非細(xì)胞溶解特性;我們?cè)谇捌趯?shí)驗(yàn)中體外檢測(cè)證實(shí)了Ad41對(duì)酸的耐受情況好于A

11、d5;隨后我們進(jìn)行動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)，設(shè)rvAd41-VP6(o)、rvAd5-VP6(o)、PBS三組分別以1×1010VP口服免疫小鼠，在同樣的免疫劑量下，三次免疫后，ELISA檢測(cè)顯示rvAd41-VP6(o)組產(chǎn)生的血清IgG抗體從陽(yáng)轉(zhuǎn)比例(100％，10/10)到抗體強(qiáng)度（OD值1.0300±0.1984）均強(qiáng)于Ad5組（30％，3/10;0.3428±0.2760），引發(fā)了更強(qiáng)的體液免疫，攻毒后對(duì)小鼠的保護(hù)作用也優(yōu)于Ad5。rvA

12、d41-VP6(o)組的小腸IgA抗體水平強(qiáng)于rvAd5-VP6(o)，誘導(dǎo)了更強(qiáng)的粘膜免疫反應(yīng)。但是，ELISpot和CBA檢測(cè)細(xì)胞免疫水平?jīng)]有得到有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的結(jié)果。結(jié)論:我們成功制備了以Ad41為載體的穩(wěn)定表達(dá)VP6基因的重組腺病毒rvAd41-VP6(o)，其在體外具有良好的生物學(xué)性質(zhì);動(dòng)物免疫結(jié)果提示，腸腺病毒載體Ad41作為疫苗載體，比Ad5更適合用于腹瀉病毒的疫苗研制。
　　 綜上所述，本研究成功構(gòu)建了人腺病毒HA