血管平滑肌線粒體損害在重癥休克血管低反應性發(fā)生中的作用.pdf

1、重癥休克時血管反應性低下,微血管對升壓藥物不起反應,帶來血壓持續(xù)下降和重要臟器灌流不足,它是晚期休克難以治療和休克死亡的重要因為之一。本室前期工作查明,休克時 ATP 生成減少,導致細動脈平滑肌細胞(arteriolarsmooth muscle cells,ASMCs)ATP敏感鉀通道(ATP-sensitive potassium channel,KATP)大量開放和細胞膜超極化,是血管平滑肌低反應性重要機制之一。但是重癥創(chuàng)傷失血性

2、休克晚期,經(jīng)過輸血、補液、升壓藥物等抗休克治療以后,血壓仍難以回升,為什么給了氧氣和養(yǎng)料以后,血管平滑肌仍然對升壓物質(zhì)不起反應。它提示重癥休克ASMCs內(nèi)ATP的減少,不僅來自氧氣和養(yǎng)料供應不足,還可能由于線粒體本身發(fā)生損傷,線粒體功能不全(mitochondrial dysfunction)使ATP合成減少。如果線粒體確實發(fā)生了損傷,保護血管平滑肌線粒體則成為防治休克低血壓新的靶點和思路,但至今尚未見報道。為此,本實驗利用大鼠失血性休

3、克模型,采用透射電鏡、熒光探針技術、生物化學發(fā)光和膜片鉗等技術,分別從線粒體、平滑肌細胞、血管反應性和整體抗休克四個不同水平研究了研究重癥失血性休克平滑肌細胞線粒體的改變及其與血管平滑肌反應性下降的關系。
　　 第一部分重癥休克血管平滑肌細胞線粒體的改變
　　 一、血管平滑肌細胞線粒體超微結(jié)構的改變:分離重癥失血性休克給予一般抗休克治療60min(單純休克組)時ASMCs,以及相同時間點假手術組、休克+環(huán)孢霉素A組、休克

4、+蒼術苷+環(huán)孢霉素A組ASMCs。用透射電鏡觀察到假手術組大鼠血管平滑肌線粒體包膜完整,嵴致密、連續(xù),基質(zhì)清楚；單純休克組線粒體腫脹,嵴排列紊亂,甚至斷裂,形成電子透亮區(qū),基質(zhì)成斑點狀,甚至空泡狀；休克前給予線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔抑制劑環(huán)孢霉素A(CsA)預處理,此組線粒體有一定的水腫,但結(jié)構較完整,嵴較致密,排列較整齊,少部分斷裂；線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔開放劑蒼術苷(ATR)可抑制環(huán)孢霉素A線粒體保護作用。結(jié)果提示重癥休克后,血管平滑肌線粒體

5、結(jié)構受損,且與線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔開放有關,抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)變可以保護線粒體。
　　 二、血管平滑肌細胞線粒體膜電位的改變:用流式細胞儀檢測陽離子熒光探針JC-1標記的平滑肌細胞線粒體膜電位的改變。提示重癥休克此期線粒體通透性轉(zhuǎn)變增加,可能促進線粒體膜電位去極化,促進線粒體結(jié)構和功能障礙。
　　 三、血管平滑肌細胞內(nèi)ATP水平的改變:利用CellTiter-Glo(R)熒光素酶生物發(fā)光法檢測細胞內(nèi)ATP相對含量。給予蒼術

6、苷預處理可以抑制環(huán)孢霉素A保護作用,平滑肌細胞內(nèi)ATP水平降低為假手術組的21.60±8.90％(與假手術組相比P=0.000；與單純休克組相比P=0.894)。以上提示抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)變和保護線粒體,可以增加重癥休克后細胞內(nèi)ATP含量。
　　 四、血管平滑肌細胞KATP通道的改變:用穿孔全細胞膜片鉗記錄法,在電壓鉗模式下,記錄并觀察KATP通道電流變化的情況,從KATP通道電流的Ⅰ-Ⅴ曲線可見,其反轉(zhuǎn)電位大約為-40mV,無

7、明顯整流特性。以上結(jié)果提示抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)變和保護線粒體,可以抑制KATP通道開放。
　　 五、血管平滑肌細胞膜電位的改變:同時應用全細胞膜片鉗術電流鉗模式,記錄單個細胞的靜息跨膜電位。單純休克組ASMCs靜息膜電位由假手術組(n=31cells)的-32.1±5.1mV增加到-48.5±8.2mV(P=0.000),提示重癥休克此期血管平滑肌細胞發(fā)生了超極化改變。環(huán)孢霉素A預處理組ASMCs靜息膜電位為-37.8±7.7mV

8、,與單純休克組差異顯著(P=0.011),其作用可被蒼術苷抑制,該組ASMCs靜息膜電位(-50.6±11.1mV)與單純休克組無顯著差異(P=0.972)。以上提示抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)變和保護線粒體,可抑制重癥休克后血管平滑肌細胞超極化。
　　 第二部分血管平滑肌線粒體損傷細胞模型的建立和對收縮反應的影響
　　 為了確證線粒體損傷能引起平滑肌收縮反應下降,用線粒體損傷劑(MPTP開放劑)ATR建立了體外平滑肌細胞線粒體損

9、傷模型,并進行了以下實驗:
　　 一、ATR對血管平滑肌細胞線粒體膜電位的影響:當加入不同濃度ATR后,引起正常細胞和休克細胞線粒體膜電位降低的細胞百分率增加,即細胞線粒體去極化,且正常細胞和休克細胞之間有顯著差異(析因分析,F=204.676,P=0.000),休克細胞組(均數(shù)為48.52％)顯著高于正常細胞組(均數(shù)為23.13％)。ATR不同濃度作用之間有顯著差異(F=101.780,P=0.000)。在正常細胞組分別在AT

10、R作用10min和30min時,隨加入ATR濃度增高,線粒體去極化越顯著,且兩兩比較均有顯著差異(F=37.907,P=0.000；F=41.501,P=0.000)。在休克細胞組分別在ATR作用10min和30min時,隨其濃度增高線粒體去極化改變有顯著差異(F=29.093,P=0.000；F=22.468,P=0.000),5μM和7.5μMATR對線粒體去極化改變均無顯著差異(10min:P=0.858；30min:P=1.00

11、0)。用藥后不同時間之間無顯著差異(F=1.055,P=0.309)。以上結(jié)果提示ATR可能通過促進線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔的開放,引起平滑肌細胞線粒體去極化,抑制線粒體作用甚至誘導線粒體損害,此作用具有一定濃度依賴性但無時間依賴性。
　　 二、ATR對血管平滑肌細胞內(nèi)ATP含量和膜電位的影響:用生物化學發(fā)光法和激光共聚焦顯微鏡技術,測定7.5μMATR體外作用于正常組和休克組血管平滑肌細胞10min對平滑肌細胞內(nèi)ATP含量和膜電位的

12、影響。正常血管平滑肌細胞在ATR作用10min后,平滑肌細胞內(nèi)ATP含量減少,比ATR處理前減少25％,有顯著差異(t=3.389,P=0.01),但ATR對正常細胞膜電位無顯著影響,提示7.5μMATR對線粒體抑制可直接導致正常平滑肌細胞內(nèi)ATP水平降低,但此改變并未影響到細胞膜電位。ATR使休克血管平滑肌細胞內(nèi)ATP含量減少,為ATR處理前的59％,有顯著差異(t=3.904,P=0.005)。膜電位發(fā)生超極化,表現(xiàn)為熒光強度減弱為

13、加藥前的72.74±4.19％(加藥前后比較用配對的t檢驗,t=14.550,P=0.000),提示此條件下休克平滑肌細胞內(nèi)ATP水平降低,它可導致細胞膜電位發(fā)生超極化改變。作為對照,溶劑HPSS對正常和休克平滑肌細胞膜電位均無顯著影響。
　　 三、ATR對血管平滑肌細胞收縮反應的影響:分別觀察了7.5μMATR體外對正常組和休克組離體血管平滑肌細胞對NE(正常組1μg/ml,休克組60μg/ml)的反應性的影響。結(jié)果表明,正常

14、血管平滑肌細胞在ATR作用10min后,用NE刺激面積減少了37.83±5.74％,與未加ATR處理的正常細胞收縮百分率(44.10±3.30％)有顯著差異(t=2.318,P=0.043)。休克血管平滑肌細胞ATR作用10min后,用NE刺激面積減少了10.94±2.78％,與未加ATR處理的休克細胞收縮百分率(25.59±2.37％)有顯著差異(t=9.816,P=0.000)(見表5)。提示線粒體抑制可直接導致平滑肌細胞收縮反應減

15、弱,可能與細胞內(nèi)ATP水平減低有關。
　　 第三部分保護線粒體藥物-CsA在整體大鼠防治休克血管低反應性和低血壓可能性
　　 為了進一步查明線粒體在重癥休克后血管低反應性發(fā)生中的作用,我們在整體試驗觀察了線粒體靶向藥物對重癥休克時血管對去甲腎上腺素(NE)的反應性和血壓影響。重癥休克失血120min后,回輸血液和給予升壓藥多巴胺(1mg/kg)后治療60min時,血管對NE刺激產(chǎn)生收縮閾值仍增高,為失血前40.9倍,血壓

16、比失血120min時僅上升了11.7mmHg。同時,在CsA預處理組,血管對NE刺激產(chǎn)生收縮閾值增加為失血前20.6倍,血壓比失血120min時上升了34.2mmHg。說明給予線粒體保護劑CsA,可降低血管對NE反應閾值(P=0.000),并可顯著增加多巴胺的升壓作用(P=0.000)；CsA預處理前給予ATR,則可消除CsA的保護效應。以上結(jié)果表明,抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)變和保護線粒體有利于恢復休克血管反應性和防止低血壓,為重癥休克頑固性

17、低血壓治療提出了一條新途徑。然而CsA可以使重癥休克動物生存時間明顯延長的同時,并不能顯著提高休克動物的24小時存活率,CsA預處理組24h動物存活率僅為3/8。說明休克低血管反應的發(fā)生還有其它機制參與,同時CsA有免疫抑制等副作用,它并不是理想的抗休克藥物。
　　 結(jié)論:
　　 1.制備線粒體損傷的細胞模型和重癥失血性休克大鼠模型,建立血管平滑肌線粒體損傷的系列測定方法,檢測它與血管收縮反應的關系。
　　 2.