線粒體功能相關因子在血管平滑肌細胞表型改變中的作用.pdf

1、目的： 動脈粥樣硬化(AS)是冠心病、腦血管意外等心腦血管疾病的病理基礎。動脈粥樣硬化的發(fā)病機理非常復雜，曾有多種學說從不同角度進行探討，但至今尚未完全明了。目前發(fā)現(xiàn)，在各種因素的作用下發(fā)生粥樣硬化的動脈中，平滑肌細胞表型的改變、增殖和遷移是病理過程的重要環(huán)節(jié)，轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣尚秃蟮钠交〖毎煞置诙喾N生長因子，使自身和周圍細胞大量增殖，并最終導致動脈管腔狹窄，粥樣斑塊和纖維帽的形成。何種因素啟動了平滑肌細胞的表型轉(zhuǎn)化目前仍不十分清楚

2、，可能與多種生長因子、代謝產(chǎn)物等因素有關。研究發(fā)現(xiàn)，在平滑肌細胞由收縮型轉(zhuǎn)化為合成型的過程中，一些細胞器，如核糖體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體以及線粒體等大量增加，線粒體的增加尤為顯著，猜測可能與細胞生長、分裂，以及分泌都需要氧化磷酸化提供大量的能量有關。但線粒體在動脈粥樣硬化的形成及平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)化過程中的確切作用還不清楚。線粒體在功能改變時，先是線粒體DNA的表達發(fā)生轉(zhuǎn)變，這種轉(zhuǎn)變受核基因和線粒體基因共同調(diào)控，與其有關的基因很多，目前認

3、為線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(mtTFA)是線粒體DNA的轉(zhuǎn)錄和復制的關鍵因子，核基因通過調(diào)節(jié)mtTFA而調(diào)控線粒體的功能，啟動線粒體內(nèi)氧化磷酸化過程相關因子的復制、轉(zhuǎn)錄和翻譯。mtTFA受核呼吸因子(NRF)的調(diào)節(jié)，有研究表明在寒冷或缺氧的條件下，NRF表達顯著增加，同時上調(diào)mtTFA，增加線粒體DNA復制，進而增加氧化磷酸化提供能量，以維持細胞的功能。近年來有研究表明，過氧化物酶體增生激活受體γ協(xié)同刺激因子(PGC—1)參與細胞內(nèi)多種物質(zhì)的代

4、謝過程，可以與多種核受體結(jié)合，調(diào)節(jié)細胞功能。為了能明確線粒體功能在動脈粥樣硬化病理發(fā)生中的作用，了解其調(diào)控的可能機制，我們應用動物模型實驗和平滑肌細胞培養(yǎng)實驗來探討可能的病理機制。 方法： 一、血管平滑肌細胞表型改變與線粒體功能調(diào)節(jié)的動物實驗研究 1、動物模型建立 雄性健康大耳白兔38只。動物模型建立及分組：將實驗兔隨機分為4組。正常對照組(C)8只，喂飼基礎飼料，實驗組(AS模型組)30只，每組10只，

5、喂飼含2％膽固醇，8％豬油，4％蛋黃粉高脂飼料。 2、血液生化指標的測定 實驗開始及第4、8、12周末由兔耳緣靜脈抽血測血清總膽固醇(TC)，甘油三脂(TG)，高密度脂蛋白膽固醇(HDL—C)濃度，低密度脂蛋白膽固醇(LDL—C)濃度。指標測定由遼寧中醫(yī)學院檢驗科全自動生化分析儀完成。 3、標本取材 實驗開始時及第4、8、12周末，分別取實驗組8只，取出主動脈，將主動脈縱行剪開，選擇主動脈弓處取材。根據(jù)不

6、同實驗技術(shù)和檢測指標，取材標本應用不同的方法處理和保存。 4、主動脈血管壁形態(tài)學觀察 取已用福爾馬林固定的主動脈弓標本經(jīng)石蠟包埋、切片，HE染色鏡檢觀察主動脈動脈病理變化。 5、PGC—1、NRF—1、mtTFA及SMemb的mRNA水平測定(RT-PCR法) 總RNA提取，用紫外分光光度計檢測核酸OD值，將原液核酸配成1μg/μl濃度。逆轉(zhuǎn)錄反應：PCR儀按94℃2min，94℃40s，57℃40s，7

7、2℃1min的條件循環(huán)35次，完成PCR反應。 6、PGC—1、NRF—1、mtTFA及SMemb的蛋白水平測定(Western—blot法) 將主動脈新鮮組織塊在生理鹽水中漂洗后，放入EP管中—70℃保存；實驗時，加入相應體積的裂解液，將樣品剪碎后勻漿，離心收集上清；取上清10μl，檢測蛋白濃度(測OD值)；按說明書進行蛋白電泳和轉(zhuǎn)膜。掃描儀掃描印記膜。 二、平滑肌細胞增殖的干預實驗 1、細胞培養(yǎng)

8、 人動脈平滑肌細胞加入培養(yǎng)基置于37℃，5％CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每兩天換一次液，當細胞長滿瓶底80％左右時，用0.1％胰蛋白酶消化傳代，第3～10代細胞用于實驗。 2、實驗分為四組 (1)正常對照組予以常規(guī)培養(yǎng)基。(2) oxLDL組，常規(guī)培養(yǎng)基中加入oxLDL使其終濃度達到10μg/ml作用24小時(3)棕櫚酸組，在(2)組方法的基礎上，培養(yǎng)基中加入棕櫚酸使其終濃度達到0.75 mmol/l作用24小時。(4)疊

9、氮鈉組，在(2)組方法的基礎上，培養(yǎng)基中加入疊氮鈉使其終濃度達到32mmol/L作用24小時。 3、各組PGC—1、NRF—1及mtTFA的蛋白表達水平檢測，應用Western—blot方法。 4、線粒體提取及功能測定線粒體提取功能測定，按試劑盒說明進行操作。 5、 MTT染色法檢測細胞活性 酶聯(lián)免疫檢測儀下選擇波長490nm測定各孔的吸光度值(OD值)。細胞增殖率(％)=(實驗組OD值—對照組OD值)/

10、對照組OD值×100％。 6、增殖細胞核抗原PCNA免疫組化檢測 SABC法免疫組化檢測培養(yǎng)細胞之增殖細胞核抗原PCNA。 結(jié)果： 一、平滑肌細胞表型改變與線粒體調(diào)控相關因子的檢測結(jié)果 1、實驗動物一般狀態(tài) 實驗過程中各組動物同期體重增加無顯著性差異(P>0.05)。 2、不同時間的血脂測定結(jié)果 隨著喂飼高脂飼料的時間延長，動物血清中血脂含量水平呈上升趨勢，其中膽固醇、低

11、密度脂蛋白水平濃度增加顯著。 3、不同時期動脈內(nèi)膜與中膜的厚度及內(nèi)膜與中膜比值 內(nèi)膜在4W、8W、12W逐漸增厚，中膜在8W、12W增厚，內(nèi)膜/中膜逐漸增加。 4、 PGC—1、NRF—1、mtTFA、SMemb的RT-PCR結(jié)果 PGC—1的mRNA表達在4W、8W、12W與喂飼高脂食物前比較差異有顯著性(p<0.01)，隨著時間的延長，其表達呈現(xiàn)上升趨勢(p<0.01)。 NRF—1的mR

12、NA表達在4W，與喂高脂食物前比較差異顯著性(p<0.01)，8W以后其表達趨于平穩(wěn)，8W和12W與4W比較差異亦有顯著性。而8W與12W比較差異無顯著性(p>0.05)。 mtTFA的mRNA表達與NRF—1趨于同步升高。 SMemb的mRNA表達隨著時間的延長，其表達呈現(xiàn)上升趨勢，4個時間段比較，差異均有顯著性(p<0.01)。 5、 PGC—1、NRF—1、mtTFA、SMemb的Westernblot

13、測定結(jié)果 PGC—1的蛋白表達4W、8W、12W與0W比較差異有顯著性，其中4W與8W、12W比較差異有顯著性(p<0.01)，而8W、12W比較差異無顯著性(p>0.05)。 NRF—1的蛋白表達在4W與0W比較差異有顯著性(p<0.01)，8W、12W與0W、4W差異有顯著性(p<0.01)。而8W與12W比較差異無顯著性(p>0.05)。 mtTFA的蛋白表達在4W與0W比較差異顯著性(p<0.05)

14、，8W、12W與0W、4W差異有顯著性(p<0.05)。而8W與12W比較差異無顯著性(p>0.05)。 SMemb蛋白表達隨時間延長亦呈現(xiàn)上升趨勢，與其mRNA水平改變一致。 二、平滑肌細胞增殖干預與線粒體功能改變的檢測結(jié)果 1、不同干預因素作用下，PGC—1/NRF—1/mtTFA蛋白水平改變 Ox—LDL組PGC—1、NRF—1、mtTFA蛋白表達增加(p<0.05)，棕櫚酸組與ox—LDL組比

15、較PGC—1、NRF—1、蛋白表達減少(p<0.05)，疊氮鈉組與ox—LDL組比較PGC—1、NRF—1、mtTFA蛋白表達是增加的(p<0.05)。 2、不同干預因素作用下，線粒體細胞色素C氧化酶活性改變 Ox—LDL組與對照組比較明顯升高(p<0.05)，棕櫚酸組與oxLDL組比較COX活性降低(p<0.05)，疊氮鈉組與oxLDL組比較明顯降低(p<0.01)。 3、不同干預因素作用下，細胞增殖活性的改

16、變 oxLDL促進細胞增殖(p<0.05)，棕櫚酸組抑制細胞增殖(p<0.05)，應用疊氮鈉后可以抑制細胞增殖(p<0.01)。 4、不同干預因素下平滑肌細胞PCNA的檢測結(jié)果 Ox—LDL組與對照組比較，PCNA蛋白表達明顯增強(p<0.05)，棕櫚酸組、疊氮鈉組PCNA蛋白表達均明顯減弱，與ox—LDL組比較差異有顯著性(p<0.01)。 結(jié)論： 動脈中膜平滑肌細胞表型由收縮型變?yōu)楹铣尚驮?/p>

17、粥樣硬化的形成中起著重要的作用。 1、在本實驗中平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)變過程中，NRF—1的表達也在逐漸升高，與mtTFA成明顯正相關。二者的表達增高和相互作用，共同調(diào)節(jié)線粒體功能，在平滑肌細胞表型改變中起著重要作用。 2、隨著平滑肌表型的改變，合成型平滑肌細胞不斷增加，PGC—1也隨著增加，并且與NRF—1成正相關，針對PGC—1的干預同樣下調(diào)了NRF—1，說明二者存在內(nèi)在的聯(lián)系。在動脈粥樣硬化過程中可能是PGC—1啟動了N