血管外膜平滑肌祖細(xì)胞在移植物血管病變中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、第一部分移植物血管外膜平滑肌祖細(xì)胞的分離、鑒定及誘導(dǎo)分化
　　目的：為了確定移植物血管病變內(nèi)膜平滑肌樣細(xì)胞來(lái)源，并了解其生物學(xué)特性。
　　方法：將C57BL/6背景的eGFP轉(zhuǎn)基因鼠與野生型C57BL/6進(jìn)行交叉骨髓移植后作為主動(dòng)脈移植的受體，然后將BALB/C供體小鼠的胸主動(dòng)脈移植入受體腹主動(dòng)脈之間。移植術(shù)后于1、2、4、6、8、10周等不同時(shí)間點(diǎn)取出移植血管進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)。使用流式分選技術(shù)將移植物血管中內(nèi)膜或外膜的eG

2、FP陽(yáng)性細(xì)胞分選出來(lái)在體外培養(yǎng)，并誘導(dǎo)分化，通過免疫熒光技術(shù)鑒定其分子標(biāo)志等。將體外培養(yǎng)純化的帶有eGFP熒光標(biāo)記的平滑肌祖細(xì)胞包裹在普通野生型C57BL/6移植血管周圍，了解其能否遷移入血管內(nèi)膜。
　　結(jié)果：骨髓來(lái)源的單核細(xì)胞在術(shù)后兩周在內(nèi)膜中達(dá)到高峰，隨后逐漸下降，但并不能表達(dá)平滑肌標(biāo)志物SM-MHC，可表達(dá)CD68等單核/巨噬細(xì)胞標(biāo)志。而在術(shù)后兩周移植血管外膜中開始出現(xiàn)一群非骨髓來(lái)源的細(xì)胞，可表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志Sca-1及早期平

3、滑肌分化標(biāo)志SM-22α等，但不能表達(dá)SM-MHC。該群細(xì)胞可遷移進(jìn)入血管內(nèi)膜逐漸表達(dá)SM-MHC，并成為增生內(nèi)膜的主要細(xì)胞。通過流式分選技術(shù)從血管外膜將該群細(xì)胞分選后并在體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)在體外經(jīng)過PDGF-BB或TGF-β誘導(dǎo)可表達(dá)SM-MHC。再體外培養(yǎng)純化的平滑肌祖細(xì)胞可從外膜遷移入內(nèi)膜并加重移植物血管病變的內(nèi)膜增生。
　　結(jié)論：移植后受體的中非骨髓細(xì)胞來(lái)源的平滑肌祖細(xì)胞可遷移入血管內(nèi)膜并分化為表達(dá)SM-MHC的平滑肌樣細(xì)胞，從

4、而促進(jìn)內(nèi)膜增生病變。
　　第二部分 miR-155可調(diào)控單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)濃度梯度誘導(dǎo)外膜血管平滑肌祖細(xì)胞向內(nèi)膜定向遷移
　　目的：了解miR-155在移植物血管病變中的作用以及對(duì)骨髓來(lái)源的單核細(xì)胞和平滑肌祖細(xì)胞的功能影響。
　　方法：將C57BL/6背景的miR-155基因敲除鼠和野生型C57BL/6小鼠進(jìn)行交叉骨髓移植后再作為主動(dòng)脈移植的受體。流式細(xì)胞儀分選出移植物血管中骨髓來(lái)源的單核細(xì)胞，使用RT

5、-PCR方法測(cè)定各種趨化因子的變化水平，并轉(zhuǎn)染miR-155mimics和inhibitor后使用ELISA測(cè)定培養(yǎng)上清細(xì)胞因子變化情況。使用RT-PCR方法測(cè)定移植血管標(biāo)本內(nèi)膜外膜間趨化因子濃度梯度水平，并通過Transwell實(shí)驗(yàn)測(cè)定在骨髓來(lái)源的單核細(xì)胞對(duì)平滑肌祖細(xì)胞遷移能力的誘導(dǎo)作用及機(jī)制。
　　結(jié)果：術(shù)后八周我們發(fā)現(xiàn)接受了miR-155敲除鼠骨髓細(xì)胞的小鼠內(nèi)膜增生病變最輕，而即使是miR-155敲除鼠接受了miR-155+

6、/+骨髓細(xì)胞小鼠也發(fā)生明顯內(nèi)膜增生。miR-155可通過抑制骨髓來(lái)源單核細(xì)胞B細(xì)胞淋巴瘤因子6的表達(dá)而促進(jìn)單核細(xì)胞趨化因子-1（MCP-1）的表達(dá)從而誘導(dǎo)平滑肌祖細(xì)胞的發(fā)生定向遷移。當(dāng)骨髓來(lái)源的單核細(xì)胞中miR-155被敲除后在移植血管內(nèi)膜外膜間MCP-1濃度梯度大幅度降低以至于難以形成有效的濃度梯度。
　　結(jié)論：miR-155可通過調(diào)控骨髓來(lái)源單核細(xì)胞功能分泌MCP-1而改變內(nèi)膜外膜之間濃度梯度，促進(jìn)平滑肌祖細(xì)胞向內(nèi)膜遷移。

7、r>　　第三部分 TGF-βI型受體磷酸激酶抑制劑（SD-208）可抑制平滑肌祖細(xì)胞的增殖和遷移能力
　　目的：評(píng)價(jià)TGF-βI型受體磷酸化酶抑制劑（SD-208）能否抑制內(nèi)膜平滑肌樣細(xì)胞的增殖及遷移能力而減輕移植物血管病變。
　　方法：BALB/c小鼠主動(dòng)脈移植到 C57BL/6小鼠腹主動(dòng)脈，術(shù)后每天給予40或60 mg/kg的SD-208灌胃，術(shù)后1、2、4、6、8周取出移植血管分析內(nèi)膜增生程度并通過免疫組化方法分析TG

8、F-β/Smad3通路各蛋白表達(dá)情況。體外培養(yǎng)中層平滑肌細(xì)胞及內(nèi)膜平滑肌樣細(xì)胞使用TGF-βand SD-208對(duì)于兩種細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，了解增殖、遷移能力的異同。
　　結(jié)果：在給予40及60 mg/kg等不同劑量的SD-208治療后，移植血管的內(nèi)膜增生程度分別比對(duì)照組下降了32％和48%。SD-208可以抑制TGF-β對(duì)于內(nèi)膜平滑肌樣細(xì)胞增殖和遷移能力的促進(jìn)作用而對(duì)于其對(duì)于中層平滑肌細(xì)胞的抑制作用并沒有明顯影響。SD-208可明顯減