神經(jīng)干細胞聯(lián)合應用丙戊酸治療對成鼠脊髓損傷的修復作用.pdf

1、脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(centlral nervous systmn，CNS)中常見的嚴重創(chuàng)傷，常導致不可逆性的感覺及運動功能喪失，主要表現(xiàn)為損傷平面以下感覺、運動功能的完全喪失和大小便失禁。脊髓損傷所致截癱不僅給患者帶來巨大的身心痛苦，而且也給其家庭和社會帶來沉重的經(jīng)濟負擔和嚴重的社會問題?，F(xiàn)代社會與建設(shè)的發(fā)展，交通事故、高空墜落、災害事故(如地震、海嘯等)、運動損傷等的頻發(fā)使脊髓損傷

2、呈現(xiàn)出“三高一低(高發(fā)生率、高傷殘率、高耗費和低死亡率)”的新特點，因而，加強脊髓損傷的救治和截癱康復研究成為廣大神經(jīng)科工作者亟待解決的熱點和難點課題。以往的治療方法多局限于脊柱骨折脫位后的復位固定、解除脊髓壓迫、控制水腫、改善微循環(huán)等對癥治療和康復治療，療效欠佳。近年來，細胞移植尤其是神經(jīng)干細胞移植從促進損傷脊髓再生與修復的目的出發(fā)，為SCI的治療帶來了新的希望。細胞移植治療SCI的原理主要為：①通過細胞移植填充脊髓缺損，給神經(jīng)元的再

3、生提供一個細胞生長和附著的場所；②提供新的神經(jīng)元，替代受損或壞死神經(jīng)元的功能，修復神經(jīng)通路；③移植細胞提供促進神經(jīng)再生的各種細胞因子，如各種神經(jīng)營養(yǎng)因子(neurotrophic fectors，NTFs，)，包括神經(jīng)營養(yǎng)素(neurotrophins，NTs)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)、神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)等，顯示了良好

4、的應用前景。 神經(jīng)干細胞(neural stem cells，Nscs)是一類廣泛存在于哺乳動物胚胎神經(jīng)組織(大腦皮層、側(cè)腦室、室管膜下層、海馬、紋狀體及中腦及脊髓)和成年動物CNS某些特定部位(大腦皮層、室管膜下區(qū)、側(cè)腦室壁、海馬齒狀回和嗅回及脊髓中央管室管膜區(qū))的一種干細胞，具有自我更新和多向分化潛能。作為修復神經(jīng)系統(tǒng)損傷的種子細胞，它不但能滿足移植時所需的細胞量，而且NSCs在一定條件下能分化為包括神經(jīng)元在內(nèi)的三種不同的神

5、經(jīng)細胞系。NSCs具有獲取、培養(yǎng)、鑒定容易，可在體外大量增殖、分化等優(yōu)點，適合作為移植實驗的供體。盡管從理論上講神經(jīng)干細胞的功能完美無缺，但近年來研究發(fā)現(xiàn)單獨NSCs應用于成年SCI的治療存在如下問題：發(fā)育的可塑性差，缺乏對NSCs定向誘導為神經(jīng)元的條件；無法解決移植后分化產(chǎn)生的神經(jīng)元少、膠質(zhì)細胞大量增生的不利情形；無法提供建立大量功能性軸突連接所需要的神經(jīng)元；且大量形成的膠質(zhì)瘢痕不僅占據(jù)軸突生長所需要的空間，而且更為嚴重的是分泌抑制軸

6、突再生的因子，不利于軸突的再生。因此，如何促進移植到損傷脊髓的NSCs向神經(jīng)元分化、抑制SCI修復過程中膠質(zhì)瘢痕的增生，成為利用NSCs移植修復損傷脊髓亟待解決的關(guān)鍵問題之一。 丙戊酸(valproic acid，vPA)作為抗驚厥、抗癲癇的一線藥物，已在臨床廣泛應用近40年，其安全性可靠。近年的研究表明，在體外細胞培養(yǎng)實驗中VPA能明顯提高NSCs向神經(jīng)元分化的比例，分化比例可高達80％左右，同時還具有保護神經(jīng)元、降低炎性反應

7、、減少膠質(zhì)細胞增生等作用。但VPA是否能促進體外神經(jīng)干細胞的增殖及在體內(nèi)促進神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元分化、抑制膠質(zhì)瘢痕形成，從而促進損傷脊髓的結(jié)構(gòu)和功能修復，目前尚未見相關(guān)的研究報道。因此，我們首先在體外細胞培養(yǎng)中觀察VPA是否具有促進NSCs增殖及向神經(jīng)元分化的作用，然后進行體內(nèi)實驗研究，將NSCs與VPA聯(lián)合應用治療成年大鼠脊髓損傷，觀察VPA作用下NSCs在體內(nèi)的存活、分化情況以及它們對成體損傷脊髓的修復作用。在體實驗分為六組：A組：脊

8、髓T10半切塊狀缺損組；B組：半切缺損處放入吸收性明膠海綿；C組：半切處放入吸收性明膠海綿，同時按300mg/kg/d腹腔注射VPA，分兩次注射；D組：半切處放入吸附有NSCs的吸收性明膠海綿；E組：半切缺損處放入吸附有移植NSCs的吸收性明膠海綿，同時按300mg/kg/d腹腔注射VPA，分兩次注射；F組：半切缺損處放入吸附有移植NSCs和1.0 mmol.L VPA的吸收性明膠海綿，同時按300mg/kg/d腹腔注射VPA，分兩次注

9、射。通過免疫組織化學和神經(jīng)病理形態(tài)學技術(shù)觀察VPAL對移植神經(jīng)干細胞分化作用的影響，用核黃和DIL進行神經(jīng)纖維逆行和順行示蹤研究，評價再生纖維的連接及軸漿運輸功能的恢復情況，最后對各組進行后肢BBB運動功能評分和電生理學功能檢測。主要的研究結(jié)果和結(jié)論如下： (1)vPA能促進培養(yǎng)NSCs的增殖，并具有一定的量效和時效關(guān)系，濃度以1.0mmol/L為最佳，時間在培養(yǎng)3-7天時增殖最明顯。 (2)vPA對培養(yǎng)NSCs的分化具

10、有重要的調(diào)控作用，能抑制NSCs向膠質(zhì)細胞分化，誘導NSCs向神經(jīng)元分化的比例可高達80％。 (3)在體研究發(fā)現(xiàn)，移植的NSCs不僅能夠存活，而且能夠向損傷周圍的脊髓組織遷移。 (4)脊髓損傷后2周內(nèi)，VPA能在一定程度上維持損傷脊髓內(nèi)移植NSCs的增殖狀態(tài)；2周后能明顯促進移植NSCs向神經(jīng)元分化。 (5)通過神經(jīng)病理學技術(shù)觀察到：NSCs移植聯(lián)合VPA治療成鼠脊髓損傷后，移植細胞能填補組織缺損，再生神經(jīng)纖維數(shù)

11、量較多、排列規(guī)則，星形膠質(zhì)細胞增生明顯受抑，未見膠質(zhì)瘢痕形成，移植部位分化神經(jīng)元可與損傷周圍脊髓組織形成良好的纖維聯(lián)系，對損傷脊髓的結(jié)構(gòu)具有較好的修復作用。 (6)通過核黃、DIL神經(jīng)纖維逆行和順行示蹤研究，觀察到NSCs移植聯(lián)合vPA治療成鼠脊髓損傷后，能夠較好地恢復損傷脊髓部位的軸漿運輸功能。 (7)通過后肢BBB運動評分和誘發(fā)電位檢測研究，觀察到Nscs移植聯(lián)合vPA治療成鼠脊髓損傷后，對后肢整體運動功能和損傷脊髓