極化巨噬細胞與脊髓來源神經干細胞聯合移植對脊髓損傷治療作用的研究.pdf

1、Ⅰ極化巨噬細胞對胚胎脊髓來源神經干細胞分化及遷移作用的研究
　　脊髓損傷（SCI）后，神經元有限的再生能力以及損傷區(qū)不利于神經再生的微環(huán)境，使得損傷愈后非常不理想。脊髓損傷后的神經干/前體細胞（NS/PCs）移植，分化而來的神經元替代缺失的神經元，促進神經環(huán)路及運動功能恢復，是最具希望的脊髓損傷治療策略。然而損傷區(qū)的微環(huán)境卻促使絕大多數移植的神經干細胞分化為星形膠質細胞，而無法達到神經元替代治療的目的。因此為移植的NS/PCs創(chuàng)造

2、適宜的內環(huán)境，是達到治療目的的重要手段。巨噬細胞是參與脊髓損傷后炎癥反應的重要免疫細胞，其分泌的多種細胞因子參與損傷微環(huán)境的調節(jié)。然而巨噬細胞的不同極化狀態(tài)決定其功能。我們利用骨髓來源的M1/M2型極化巨噬細胞條件性培養(yǎng)基體外培養(yǎng)小鼠胚胎脊髓來源的NS/PCs。M1型條件培養(yǎng)基（M1-CM）促進NS/PCs分化成星形膠質細胞的比例明顯高于對照組及M2型條件培養(yǎng)基組；相比之下，M2-CM則促進NS/PCs分化成更多的神經元及少突膠質細胞。

3、將NS/PCs分別與M1或M2巨噬細胞聯合移植入正常和損傷的小鼠脊髓后，移植的M1型巨噬細胞可促進NS/PCs向星形膠質細胞方向分化；而M2型巨噬細胞卻可以使NS/PCs更多的分化為神經元及少突膠質細胞，分化的神經元可以與宿主神經元細胞發(fā)生整合，促進脊髓損傷后運動功能的恢復。此外，極化的巨噬細胞與NS/PCs聯合移植入脊髓后，M1型巨噬細胞促進NS/PCs來源的細胞發(fā)生遠距離遷移，而M2型巨噬細胞則促進NS/PCs來源的細胞聚集在損傷區(qū)

4、內，上述兩種遷移模式具有趨化因子受體4（CXCR4）依賴性。我們的研究提示：NS/PCs與極化巨噬細胞聯合移植可能是脊髓損傷修復有效的治療策略。
　　Ⅱ脊髓神經干細胞對巨噬細胞極性的影響
　　巨噬/小膠質細胞是CNS免疫應答的主要調節(jié)細胞，研究發(fā)現移植的NS/PCs具有免疫調節(jié)功能，但NS/PCs對脊髓損傷后M1及M2型巨噬細胞的調節(jié)作用及機制還不清楚。我們利用 AR-/-、PD1-/-兩種工具鼠在體內外觀察脊髓來源干細胞對

5、 M1及 M2型巨噬細胞極化狀態(tài)的影響，以了解外源性移植的神經干細胞對在體免疫反應的調控及調控機制，為CNS損傷的細胞治療提供理論依據。
　　在體外將胚胎脊髓來源NS/PCs與體外極化培養(yǎng)的M1型巨噬細胞直接接觸混合培養(yǎng)發(fā)現NS/PCs會降低CD11b+CD86+M1型巨噬細胞比例；當將體外極化的M1、M2型巨噬細胞及NS/PCs三者接觸混合培養(yǎng)時，共培養(yǎng)組CD11b+CD86+M1型巨噬細胞比例同樣少于對照組。將NS/PCs移植

6、入AR-/-、PD1-/-小鼠SCI模型損傷區(qū)后1周，發(fā)現NS/PCs移植組脊髓損傷區(qū)iNOS+細胞比例明顯減少；5周時NS/PCs移植組 Arg1+細胞比例多于對照組，結果提示 NS/PCs在體內免疫應答起始階段會減少CD86+iNOS+的M1巨噬細胞的數量，但在損傷后期會使損傷區(qū)的Arg1+M2型巨噬細胞聚集，延遲固有免疫應答。體內實驗發(fā)現移植NS/PCs能使脊髓損傷區(qū)NeuN+細胞數增多，并能有效促進運動功能恢復。趨化因子對脊髓損

7、傷后單核細胞的浸潤具有重要作用，QRT-PCR檢測發(fā)現M1型巨噬細胞高表達趨化因子及受體CCR2/MCP-1及CCR5/MIP-1，M1-CM條件培養(yǎng)的NS/PCs低表達CCR2/MCP-1及CCR5/MIP-1，二者是否通過調節(jié)趨化因子的表達發(fā)揮脊髓損傷后的免疫調節(jié)作用以及其他可能的調控機制有待進一步驗證。
　　Ⅲ神經干細胞組織特異性差異的研究
　　盡管神經干細胞已用于多種CNS疾病的移植治療，并取得了一定療效，但神經干細

8、胞的調控機制如分化、增殖及在病理狀況下的調控還不十分清楚。我們體外培養(yǎng)神經干細胞過程中發(fā)現，CNS不同組織來源的神經干細胞（海馬神經干細胞和脊髓神經干細胞）生長速度及對消化酶的耐受能力不同，因此我們首先驗證了兩種不同來源神經干細胞增殖速度的差異，并分析其調控機制。細胞粘附分子是調控細胞增殖及分化的重要因素，因此我們檢測細胞粘附相關分子在不同來源干細胞及在損傷和正常干細胞中的表達情況，目的是探討調控神經干細胞組織特異性及脊髓神經干細胞特性

9、的重要調控機制，為脊髓損傷治療尋找新的出路。結果發(fā)現不同時期脊髓來源干細胞Ki67+、BrdU+及PHH3+細胞數少于海馬干細胞，結果提示脊髓干細胞增殖速度慢于海馬來源干細胞；損傷脊髓干細胞 Ki67+及 BrdU+細胞數多于正常脊髓干細胞，說明組織損傷可以加快神經干細胞的增殖；免疫熒光染色發(fā)現脊髓干細胞細胞粘附相關分子如N-cadherin、β-catenin、RhoA、Pax6表達強于海馬干細胞，它們在調控干細胞的粘附、增殖及其他生