粉塵螨變應(yīng)原Derf2、Derf5基因的克隆表達(dá)及免疫學(xué)初步研究.pdf

1、隨著人們生活方式的變化和環(huán)境污染，過(guò)敏性疾病的發(fā)病率不斷上升。過(guò)敏性疾病不僅危害人們的健康，而且給家庭和社會(huì)造成巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。螨類(lèi)引起的過(guò)敏反應(yīng)是人類(lèi)最常見(jiàn)的變態(tài)反應(yīng)。塵螨是20世紀(jì)60年代發(fā)現(xiàn)的一種最強(qiáng)烈的變應(yīng)原，也是室內(nèi)變應(yīng)原中最主要的成分，多數(shù)哮喘、過(guò)敏性鼻炎及過(guò)敏性濕疹與塵螨有關(guān)，嚴(yán)重影響人體健康，但目前仍沒(méi)有理想的檢測(cè)試劑及治療方法。我國(guó)在該類(lèi)疾病的診治中所用的大多數(shù)是螨浸液，其中存在各種難以標(biāo)化的變應(yīng)原性和非變應(yīng)原性成分，

2、在免疫治療過(guò)程中容易產(chǎn)生各種意想不到的副作用，如在治療過(guò)程中出現(xiàn)嚴(yán)重的過(guò)敏反應(yīng)，不可逆的氣道痙攣等，而且變應(yīng)原的來(lái)源不易，制備蛋白質(zhì)提取純化工藝要求較高，蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)化較困難等問(wèn)題。因此，螨浸液用于螨類(lèi)變態(tài)反應(yīng)疾病的診治存在很多不足。研制安全高效新型變應(yīng)原疫苗具有重要意義。 研究目的 鑒于直接從粉塵螨中分離純化粉塵螨Ⅱ類(lèi)、Ⅴ類(lèi)主要變應(yīng)原難度較大，本研究采用基因克隆和重組表達(dá)技術(shù)，獲得廣州地區(qū)粉塵螨Ⅱ類(lèi)、Ⅴ類(lèi)變應(yīng)原的全長(zhǎng)基因

3、，構(gòu)建Derf2、Derf5基因原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行蛋白表達(dá)，以期獲得重組蛋白的高效表達(dá)，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)國(guó)產(chǎn)塵螨變應(yīng)性疾病診斷試劑盒打下基礎(chǔ)，為螨類(lèi)變態(tài)反應(yīng)疾病的免疫治療提供高純度、易于標(biāo)準(zhǔn)化的重組變應(yīng)原蛋白。研究方法提取廣州地區(qū)粉塵螨總RNA，并根據(jù)已知的粉塵螨Ⅱ類(lèi)、Ⅴ類(lèi)變應(yīng)原基因完整序列設(shè)計(jì)特異性引物，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板PCR擴(kuò)增兩條基因，并進(jìn)行TA．克隆獲得粉塵螨Ⅱ類(lèi)、Ⅴ類(lèi)變應(yīng)原基因。 將粉塵螨Ⅱ類(lèi)、Ⅴ類(lèi)變應(yīng)原基

4、因分別定向克隆至原核表達(dá)載體P<'GEX-4T-1>、P<'ET-30a(+)>，構(gòu)建P<'GEX>-Derf2、P<'ET>-Derf5原核表達(dá)質(zhì)粒；轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21，進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE和Western-bloting分析鑒定。 純化粉塵螨Ⅴ類(lèi)變應(yīng)原蛋白，免疫大鼠，5周后獲得多克隆抗體血清；利用ELISA分別檢測(cè)大鼠血清、病人血清及正常人血清，了解該蛋白的診斷價(jià)值及免疫學(xué)功能；并對(duì)粉塵螨Ⅴ

5、類(lèi)變應(yīng)原進(jìn)行組織化學(xué)定位。 研究結(jié)果 1．構(gòu)建Derf2、Derf5基因克隆菌株并進(jìn)行序列測(cè)定構(gòu)建的T-Derf2/JM109、T-Derf5/JM109克隆菌株，經(jīng)PCR鑒定、酶切鑒定、測(cè)序結(jié)果分析表明，克隆獲得廣州地區(qū)粉塵螨Derf2、Derf5全長(zhǎng)基因。兩者分別與GenBank中日本來(lái)源的Derf2、Derf5基因同源性為99﹪，推導(dǎo)氨基酸序列同源性也為99﹪。 2．構(gòu)建表達(dá)載體并實(shí)現(xiàn)了目的蛋白的體外表達(dá)構(gòu)

6、建的p<'GEX>-Derf2、p<'ET>-Derf5表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)轉(zhuǎn)化獲得可表達(dá)目的蛋白質(zhì)的大腸桿菌工程菌株p<'GEX>-Derf2/BL21、P<'ET>-Derf5/BL21，經(jīng)SDS-PAGE分析顯示目的條帶大小，與理論值相符；經(jīng)Western-bloting分析目的蛋白可分別被抗GST抗體、抗HIS抗體識(shí)別。 3．重組蛋白的純化和動(dòng)物免疫重組蛋白P<'ET>-Derf5/BL21經(jīng)HIS標(biāo)簽結(jié)合柱純化，鑒定為目的蛋白

7、，ELISA分析目的蛋白免疫診斷價(jià)值；分別被豚鼠抗粉塵螨血清，人抗塵螨血清識(shí)別，正常人群有一定的假陽(yáng)性率；利用獲得純化蛋白免疫大鼠，5周后ELISA檢測(cè)血清成強(qiáng)陽(yáng)性，效價(jià)達(dá)1：24,000。 4．粉塵螨Ⅴ類(lèi)變應(yīng)原組織化學(xué)定位組織定位結(jié)果表明粉塵螨Ⅴ類(lèi)變應(yīng)原主要是消化道內(nèi)容物。 結(jié)論 1．獲取廣州地區(qū)粉塵螨Ⅱ類(lèi)、Ⅴ類(lèi)變應(yīng)原全長(zhǎng)基因，并成功構(gòu)建克隆菌株T-Derf2/JM109、T-Derf5/JM109，并對(duì)序列