粉塵螨Ⅰ、Ⅱ類變應(yīng)原的克隆、表達(dá)研究.pdf

1、學(xué)位論文粉塵螨I、II類變應(yīng)原的克隆、表達(dá)研究CloningandExpressionofcDNAcodingforgroupIandIIallergenofDermatophagoidesfarinae安徽省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(NO03043303)學(xué)位授予單位申請(qǐng)學(xué)位層次申請(qǐng)學(xué)位類型專業(yè)名稱研究方向?qū)W生姓名導(dǎo)師姓名論文提交時(shí)間安徽理工大學(xué)碩士醫(yī)學(xué)病原生物學(xué)醫(yī)學(xué)節(jié)肢動(dòng)物學(xué)楊慶貴李朝品教授2005年4月粉塵螨I、II類變應(yīng)原的克隆、表

2、達(dá)研究安徽理工大學(xué)碩士論文2005年4月摘要目的對(duì)淮南地區(qū)粉塵螨I、II類變應(yīng)原eDNA進(jìn)行克隆、表達(dá)。方法采集淮南地區(qū)粉塵螨進(jìn)行人工飼養(yǎng)，用Trizol提取總RNA，以O(shè)ligodTAdaptorPrimer為反轉(zhuǎn)錄引物，使用TaKaRaRNALAPCRTMKit(AMV)Ver11合成eDNA。根據(jù)OenBank粉塵蝻Derfl、Derf2eDNA基因序列(登錄號(hào)分別為：emblX651961，D10448)，分別設(shè)計(jì)、合成一對(duì)特異

3、性引物，采用RTPCR、PCR法擴(kuò)增出目的基因片段，按照常規(guī)的基因操作技術(shù)進(jìn)行Derf1eDNA、Derf2eDNA的克隆、亞克隆、表達(dá)及鑒定。挑選出陽(yáng)性克隆菌(含pMD一18TDerfl、pMD18TDerf2)進(jìn)行序列測(cè)定，并亞克隆至表達(dá)質(zhì)粒，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a()一Derf1、pET32a()Derf2，誘導(dǎo)Derf1、Derf2基因的表達(dá)，進(jìn)行Derfl、Derf2蛋白的SDS—PAGE分析，并對(duì)SDS隊(duì)GE蛋白條帶進(jìn)

4、行凝膠掃描定量分析。結(jié)果①行RTPCR、PCR，自粉塵螨基因組中特異擴(kuò)增出大小約646bp、455bp基因片段。②pMD18TDerf1和pMD18TDerf2重組質(zhì)粒中插入片段的測(cè)序結(jié)果與OenBank登錄的相應(yīng)序列比較，發(fā)現(xiàn)Derf1核苷酸同源性為9952％，其讀碼框自9至638：Derf2與郝敏麒等報(bào)道的廣州地區(qū)粉塵螨Derf2的cDNA序列(AF346905)相比，未發(fā)現(xiàn)有插入序列。③表達(dá)載體pET32a()一Derf1、pEY

5、32a()Derf2經(jīng)酶切及PCR擴(kuò)增后，在預(yù)期位置上可見DNA條帶，證實(shí)表達(dá)載體構(gòu)建成功。④含pET32a()Derf1、pET32a()一Derf2工程菌經(jīng)超聲破碎集菌后，分別取其上清及沉淀行SDSPAGE分析，發(fā)現(xiàn)沉淀中有目的蛋自的表達(dá)，其分子量分別約為45kDa、34kDa。結(jié)論①成功進(jìn)行粉塵螨Derfl、Derf2cDNA體外擴(kuò)增，序列分析結(jié)果證實(shí)，淮南地區(qū)Derf1eDNA與國(guó)外粉塵蛹DerfleDNA序列存在一定差異，De