喹賽多對(duì)DNA甲基化、組蛋白修飾和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響.pdf

1、喹賽多是抗菌促生長(zhǎng)作用較好的一種喹噁啉類(lèi)藥物，其對(duì)動(dòng)物機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生重要影響，適合用于食品動(dòng)物的養(yǎng)殖業(yè)。雖然目前已有大量關(guān)于喹賽多藥理學(xué)機(jī)制的研究，但是喹賽多促生長(zhǎng)作用的分子機(jī)制仍然不是很清楚。前期已經(jīng)從喹賽多作用下基因的表達(dá)、蛋白和激素的分泌、表型的變化等方面進(jìn)行了研究，但是由于生物體是一個(gè)復(fù)雜的體系，其生長(zhǎng)受到很多因素的影響，為了更好的說(shuō)明喹賽多促生長(zhǎng)作用仍需從多方面進(jìn)一步研究。表觀遺傳學(xué)變化主要是指遺傳物質(zhì)的修飾，如DNA的甲

2、基化、組蛋白修飾和染色質(zhì)重塑等，這些遺傳物質(zhì)的修飾可以通過(guò)影響基因的啟動(dòng)來(lái)對(duì)基因的表達(dá)變化產(chǎn)生調(diào)控，進(jìn)而對(duì)機(jī)體的生長(zhǎng)、發(fā)育產(chǎn)生影響。那么喹賽多作用于細(xì)胞后是否可以引起機(jī)體表觀遺傳學(xué)變化？喹賽多是否可以通過(guò)影響表觀遺傳學(xué)變化進(jìn)而影響機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育？答案是未知的，仍需進(jìn)一步研究。
　　在動(dòng)物機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，內(nèi)分泌系統(tǒng)起著極其重要的作用，其中IGF-1(Insulin-like Growth Factor-1)是機(jī)體正常生長(zhǎng)發(fā)育不

3、可缺少的物質(zhì)，而肝臟不但是IGF-1的主要分泌器官，而且還是各種不同藥物與機(jī)體直接接觸及在體內(nèi)進(jìn)行代謝的主要器官。為了進(jìn)一步揭示喹賽多的促生長(zhǎng)作用機(jī)理，本課題以重組生長(zhǎng)激素(rGH)為對(duì)照藥，以基因IGF-1為切入點(diǎn)，以大鼠的肝細(xì)胞(BRL細(xì)胞)為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行相應(yīng)的表觀遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)。
　　1.喹賽多于BRL細(xì)胞時(shí)間和劑量的確定（篩選對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)最有利的條件）
　　本課題采用MTT法，以細(xì)胞線粒體內(nèi)產(chǎn)生的琥珀酸脫氫酶(SDH)的含

4、量為指標(biāo)，檢測(cè)藥物作用下細(xì)胞的活力，并結(jié)合細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)和IGF-1 mRNA表達(dá)量來(lái)確定喹賽多和對(duì)照藥物rGH作用于BRL細(xì)胞的時(shí)間和劑量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，1μmol/L的喹賽多和0.163×2-8 IU/ml的rGH分別作用于BRL細(xì)胞4h后細(xì)胞中SDH的含量相對(duì)較高，且細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況良好，基因IGF-1 mRNA表達(dá)水平上調(diào)明顯，且與生長(zhǎng)相關(guān)的基因GHR mRNA表達(dá)水平和IGF-1R mRNA表達(dá)水平也上調(diào)明顯，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育有利，

5、由此確定可以用1μmol/L的喹賽多和0.163×2-8 IU/mL的rGH分別作用于BRL細(xì)胞4h進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。
　　2.喹賽多對(duì)BRL細(xì)胞內(nèi)DNA甲基化的影響
　　用1μmol/L的喹賽多和0.163×2-8 IU/mL的rGH(對(duì)照藥)分別作用于BRL細(xì)胞4h，發(fā)現(xiàn)喹賽多和rGH都可以引起B(yǎng)RL細(xì)胞基因組DNA甲基化水平增加，不利于某些基因的表達(dá)，而且BRL細(xì)胞基因組DNA甲基化水平會(huì)隨著喹賽多劑量的增加而改變，不會(huì)

6、隨著時(shí)間的改變而發(fā)生變化。用BSP法檢測(cè)基因IGF-1啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平卻發(fā)現(xiàn)1μmol/L的喹賽多和0.163×2-8 IU/mL的rGH分別作用于BRL細(xì)胞4h后可以引起基因IGF-1啟動(dòng)子區(qū)域大部分CpG位點(diǎn)甲基化水平降低，這一現(xiàn)象是有利于轉(zhuǎn)錄因子與基因IGF-1啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，有利于基因IGF-1的轉(zhuǎn)錄，促使IGF-1 mRNA表達(dá)水平增加。通過(guò)RT-PCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)DNA甲基化水平的變化可能與DNA甲基

7、化相關(guān)酶DNMT1、DNMT3A和DNMT3B有關(guān)，可能是藥物通過(guò)影響DNA甲基化相關(guān)酶的變化進(jìn)而影響細(xì)胞內(nèi)的DNA甲基化水平。
　　3.喹賽多對(duì)BRL細(xì)胞內(nèi)組蛋白修飾(H3K4me3和H3K27ac)的影響
　　細(xì)胞內(nèi)組蛋白H3K4me3修飾水平和H3K27ac修飾水平與基因的轉(zhuǎn)錄水平有關(guān)，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生重要影響。研究發(fā)現(xiàn)喹賽多和rGH都可以引起B(yǎng)RL細(xì)胞內(nèi)H3K4me3修飾水平和H3K27ac修飾水平明顯降低，且在

8、0～4 h內(nèi)隨著細(xì)胞與藥物接觸時(shí)間的增加，BRL細(xì)胞內(nèi)H3 K4me3修飾和H3K27ac修飾水平逐漸降低，這一現(xiàn)象對(duì)某些基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)是不利的。通過(guò)ChIP-qPCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，喹賽多和rGH都可以引起B(yǎng)RL細(xì)胞內(nèi)基因IGF-1啟動(dòng)子區(qū)域H3K4me3修飾和H3K27ac修飾水平明顯增加，促進(jìn)IGF-1 mRNA表達(dá)水平。而且研究發(fā)現(xiàn)這些組蛋白H3K4me3修飾水平和H3K27ac修飾水平的增減可能與H3K4me3修飾酶和H3K27ac

9、修飾酶密切相關(guān)。
　　4.喹賽多對(duì)BRL細(xì)胞內(nèi)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響
　　為了進(jìn)一步觀察喹賽多和對(duì)照藥rGH作用于BRL細(xì)胞后對(duì)細(xì)胞內(nèi)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響，我們以細(xì)胞內(nèi)染色質(zhì)上組蛋白H3K4me3修飾和H3K27ac修飾為參照，結(jié)合激光共聚焦顯微鏡觀察喹賽多和對(duì)照藥物rGH對(duì)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BRL細(xì)胞在喹賽多和對(duì)照藥物rGH作用下BRL細(xì)胞核中可見(jiàn)空間變小，染色質(zhì)之間的空隙變得更大。添加抑制劑5-氮雜-2脫氧胞嘧啶核苷后，

10、與喹賽多處理組和rGH處理組相比，細(xì)胞中細(xì)胞核內(nèi)可見(jiàn)空間變大，細(xì)胞中染色質(zhì)之間的空隙變得更小。由此可以推測(cè)BRL細(xì)胞在喹賽多和rGH作用下染色質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，變得更加疏松，有利于轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成，可能更有利于基因(如基因IGF-1)的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。
　　通過(guò)對(duì)研究結(jié)果進(jìn)行分析，可知:第一，喹賽多和rGH都可能通過(guò)調(diào)控DNMTs影響細(xì)胞內(nèi)DNA甲基化程度，一方面，引起B(yǎng)RL細(xì)胞內(nèi)基因組DNA甲基化水平增加，抑制某些基因表達(dá)，另一

11、方面，卻可以引起基因IGF-1啟動(dòng)子區(qū)域大部分CpG位點(diǎn)甲基化水平降低，促進(jìn)基因IGF-1 mRNA表達(dá);第二，喹賽多和rGH都可能通過(guò)影響H3K4me3修飾酶和H3K27ac修飾酶，引起B(yǎng)RL細(xì)胞內(nèi)H3K4me3修飾水平和H3K27ac修飾水平在0～4 h逐漸降低，抑制某些基因的表達(dá)，但是卻可以引起基因IGF-1啟動(dòng)子區(qū)域H3K4me3修飾水平和H3K27ac修飾水平明顯增加，促進(jìn)基因IGF-1的轉(zhuǎn)錄;第三，BRL細(xì)胞在喹賽多和rGH