礦物粉塵誘導(dǎo)基因?qū)?xì)胞生物學(xué)行為、組蛋白甲基化和異染色質(zhì)的影響.pdf

1、目的：
　　礦物粉塵誘導(dǎo)基因(mineral dust-induced gene，簡稱mdig)是由長期暴露于礦物粉塵的礦工的肺泡巨噬細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的，mdig也被發(fā)現(xiàn)在c-Myc過表達(dá)的腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，命名為mina53(myc-induced nuclear antigen53)或MINA。因為mdig蛋白主要分布在細(xì)胞核，所以還稱之為NO52(nucleolar protein52)。許多人類腫瘤中，比如肺癌、結(jié)腸癌、食管鱗狀

2、細(xì)胞癌、牙齦鱗狀細(xì)胞癌、淋巴瘤、腎細(xì)胞癌、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、胃癌、肝細(xì)胞癌、膽管癌和乳腺癌，mdig的表達(dá)增加，表明mdig在人類癌癥形成過程中起到重要作用。然而，mdig基因如何促進(jìn)癌癥發(fā)展的仍然未完全闡明。
　　Mdig蛋白包含一個保守的JmjC結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域被發(fā)現(xiàn)在Fe(Ⅱ)家族和2-氧戊二酸鹽依賴的雙加氧酶參與下發(fā)揮組蛋白去甲基化酶的作用。以前的研究表明在人類氣管上皮細(xì)胞系BEAS-2B中，mdig降低組蛋白H3的9位點(diǎn)賴氨

3、酸的三甲基化(H3k9me3)狀態(tài)。同樣在大批人類肺癌標(biāo)本檢測中被證實，增加mdig表達(dá)與H3k9me3的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。此外，有證據(jù)證實mdig可能通過促進(jìn)細(xì)胞周期從G1期到S期和/或rRNA的合成影響細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)。而且，mdig被發(fā)現(xiàn)能夠影響核仁外基因的表達(dá)，例如在T輔助細(xì)胞中抑制IL-4表達(dá)。最近研究表明，mdig作為2-氧戊二酸鹽氧合酶負(fù)責(zé)Rp127a組氨酰基羥基化，Rp127a是60S核糖體的亞基，對于蛋白質(zhì)的翻譯起重要作用

4、。
　　H19基因是父系印跡但母系表達(dá)的胚基因，轉(zhuǎn)錄基因間長鏈非編碼RNA(lincRNA)，位于人類染色體11p15.5。在胚胎形成初期，父系及母系的H19等位基因均表達(dá)，可是在大多數(shù)成人組織中，因為H19基因位點(diǎn)內(nèi)高階異染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的形成，父系H19等位基因沉默了，因此DNA甲基化和H3k9me3形成。自從1990年發(fā)現(xiàn)H19基因，它在癌癥發(fā)展中的作用就備受爭議。許多證據(jù)顯示H19更趨向于致癌基因，而非腫瘤抑制基因。首先，很多人

5、類癌癥，包括肝細(xì)胞癌，肺癌，食管癌，結(jié)腸直腸癌，膀胱癌，前列腺癌，尤文氏肉瘤，生殖細(xì)胞癌中H19表達(dá)均增加;其次，H19的異位表達(dá)加強(qiáng)了乳腺癌細(xì)胞的致腫瘤性。再次，通過siRNA減弱肺癌細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞的集落形成和不依賴支持物生長來沉默H19基因;最后，H19的表達(dá)被c-Myc和E2F1致癌基因上調(diào)。先前報道過在肝細(xì)胞癌中提高JNK1活化增加H19表達(dá)。因為mdig與rRNA基因調(diào)節(jié)有關(guān)，因為基因位點(diǎn)異染色質(zhì)的形成，許多rRNA基因被抑

6、制。
　　本實驗通過轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞系建立沉默和過表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞系，評估m(xù)dig基因在細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲中的作用，探索mdig是否也有能力調(diào)節(jié)串聯(lián)重復(fù)的DNA區(qū)域基因的表達(dá)，如H19基因。最終，探討mdig基因在肺癌的發(fā)生發(fā)展中的可能機(jī)制。
　　材料與方法：
　　1、細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染
　　人類肺腺癌上皮細(xì)胞系A(chǔ)549和人類支氣管上皮細(xì)胞系BEAS-2B購于美國典型微生物菌種保藏中心(ATCC)。A549細(xì)胞的培養(yǎng)

7、基:RPMI1640培養(yǎng)液（美國Invitrogen公司）+10％胎牛血清（美國Sigma公司）+1％青霉素-鏈霉素溶液（美國Sigma公司）+1％谷氨酰胺（美國Sigma公司）。BEAS-2B細(xì)胞培養(yǎng)基:DMEM培養(yǎng)液（美國Invitrogen公司）+5％胎牛血清（美國Sigma公司）+1％青霉素-鏈霉素溶液（美國Sigma公司）+1％谷氨酰胺（美國Sigma公司）。在37℃，5％CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)。5×105個細(xì)胞傳代到六孔

8、板，培養(yǎng)到細(xì)胞覆蓋率達(dá)60-70％時，用Lipofectamine2000(Invitrogen)試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染。Mdig-GFP質(zhì)粒和control-GFP質(zhì)粒，沉默mdig的shRNAs-RFP和control-RFP質(zhì)粒購于OriGene。為了建立穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染克隆，加入篩選抗生素3周，（過表達(dá)的質(zhì)粒嘌呤霉素濃度2μg/ml，沉默質(zhì)粒G418濃度1000μg/ml），挑選GFP-或者RFP-陽性的克隆來進(jìn)行進(jìn)一步實驗。在一些實驗中，用s

9、iRNA短暫沉默mdig表達(dá)。Control-siRNA和mdig-siRNA購于Qiagen。六孔板內(nèi)的細(xì)胞（5×105/孔）傳代時用50 nM/孔siRNA進(jìn)行反向轉(zhuǎn)染，24 h后用50 nM/孔siRNA進(jìn)行正向轉(zhuǎn)染，應(yīng)用Lipofectamine RNAiMAX試劑(Invitrogen)并遵照制造商的操作說明。培養(yǎng)24 h或48 h后，裂解細(xì)胞獲得RNA或蛋白的提取物。
　　2、Western blotting
　

10、　用RIPA溶液(Millipore)+磷酸酶/蛋白酶抑制劑+1 mM PMSF，超聲，離心提取細(xì)胞總蛋白，應(yīng)用微量BCA蛋白測定試劑盒(Thermo Scientific)進(jìn)行蛋白定量，按量加入含有1mM二硫蘇糖醇的LDS樣本緩沖液(Invitrogen)中，95℃加熱5 min，10％或者15％ SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉(zhuǎn)膜到PVDF膜(Invitrogen)，應(yīng)用相應(yīng)的抗體檢測相應(yīng)的蛋白。
　　3、RT-PCR
　

11、　用TRIzol Reagent提取細(xì)胞總RNA，在LightCycler480儀器上用SYBRGreen High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits(Applied Biosystems)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，引物包括:
　　Mdig5'-TCA TGT CGG GCC TAA GAG AC-3'和5'-GGC ATT TGA TTC TGC AAA GG-3'
　　GAPDH5'-CT

12、G AAC GGG AAG CTC ACT GGC ATG GCC TTC-3'和5'-C AT GAG GTC CAC CAC CCT GTT GCT GTA GCC-3'
　　H195'-AAAGACACCATCGGAACAGC-3'和5'-AGAGTCGTGGAGGCTTTGAA-3';
　　IGF25'-TCCTCCCTGGACAATCAGAC-3'和5'-AGAAGCACCAGCATCGACTT-3';
　　

13、Jhdm3a5'-CTGTCCATAAAATATCGAAATACCCTA-3'和5'-TACAGTATATAAATACATAATTTGGGC-3';
　　c-Myc5'-TACCCTCTCAACGACAGCAG-3'和5'-TCTTGACATTCTCCTCGGTG-3';
　　大衛(wèi)星DNA X565'-CTCAGGTCTCTTGGCTTTGC-3'和5'-GTGCGGAGGGTAGAGTGGTA-3'
　　4、免疫熒光

14、
　　6×104個細(xì)胞傳代至六孔板，培養(yǎng)24 h，4％甲醛固定，PBS洗三次，每次15 min，封閉液封閉60 min，用溶于抗體稀釋液的一抗孵育，4℃過夜，用溶于抗體稀釋液的熒光二抗孵育，避光室溫1h，PBS洗三次，每次5 min，4，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)溶液(0.1 mg/ml)孵育2 min，通過熒光顯微鏡觀察。
　　5、細(xì)胞增殖實驗
　　5×103/孔細(xì)胞，500μl培養(yǎng)液，傳代到96孔板，在檢

15、測時間點(diǎn)上，每孔加入20μl MTT溶液(5 mg/ml溶于PBS，Sigma)，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3.5 h。更換孔內(nèi)溶液為150μl of DMSO(Fisher)溶解甲瓚結(jié)晶。搖床15 min，用Biokineticsplate reader(Bio-Tek Instruments)檢測570 nm-690 nm波長吸光度。
　　6、轉(zhuǎn)移和侵襲實驗
　　應(yīng)用BD BioCoatTM MatrigelTM Invas

16、ion和Migration Chambers遵照用法說明檢測細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力。培養(yǎng)24 h（轉(zhuǎn)移）或者48 h（侵襲）后，用棉簽擦除濾過膜上層的細(xì)胞，用Diff-Quik Kit染色濾過膜底層細(xì)胞后，在顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。
　　7、染色質(zhì)免疫沉淀實驗(ChIP)
　　ChIP實驗應(yīng)用染色體免疫沉淀試劑盒(Millipore)，遵照制造商的操作說明。簡略說，用抗H3K9me3抗體或者作為對照的正常的兔IgG(Santa

17、CruzBiotechnology)免疫沉淀基因組DNA-蛋白復(fù)合物，超聲，通過SYBR Green-based quantitative real-time PCR(Roche，LightCycler480)用包含H19基因啟動子和ICR區(qū)域的引物擴(kuò)增沉淀的DNA。ChIP PCR引物包括:（括號內(nèi)的數(shù)字顯示相應(yīng)的GenBank ID AF125183系列區(qū)域）。
　　5'-CCAGCCATGTGCAAAGTATG-3'(974

18、7-9766)
　　5'-CCATCCTGGAATTCTCCAAA-3'(9939-9920)
　　5'-GCGGTCTTCAGACAGGAAAG-3'(9468-9487)
　　5'-CACGTTCCTGGAGAGTAGGG-3'(9673-9654)
　　5'-TCTTCAGGTCGGGCATTATC-3'(8112-8131)
　　5'-GCTGTCCTTAGACGGAGTCG-3'(8290-827

19、1)
　　8、體外組蛋白去甲基化實驗
　　按照先前的報道進(jìn)行體外組蛋白去甲基化實驗。簡略說，從mdig過表達(dá)細(xì)胞系用mdig抗體(Abcam)免疫沉淀法獲得mdig蛋白。H3K9三甲基化組蛋白肽鏈(Epigentek)在組蛋白去甲基化溶劑[50 mM Hepes-KOH(pH:7.5)，70μM Fe(NH4)2(SO4)2，1 mMα-ketoglutarate，2mM L-ascorbic acid]中與沉淀復(fù)合物在37

20、℃培育1-3 h。為了質(zhì)譜(MS)分析，反應(yīng)復(fù)合物(1μl)用0.1％ TFA稀釋20倍，用ZipTip pipette tips(Millipore)脫鹽。肽鏈被4μl30％ CH3CN/0.1％ formicacid洗脫三次。收集洗脫物，用5-80％線性梯度的溶液B(80％ ACN and0.1％FA)，用C18反相色譜柱(75μm ID，長度15 cm)中流速250 nL/min，內(nèi)部在試劑A(0.1％ FA)中用ReproSil

21、-Pur C18-AQμm resin(Dr.Maisch GmbH)包裹，分離超過20 min。在線將Orbitrap Elite儀器(Thermo Scientific)和nanoflow Easy-nLC系統(tǒng)連接。MS數(shù)據(jù)在波長掃描(300-1650 Th)中基于前提豐富用Top-20-rCID數(shù)據(jù)依賴策略篩選碎裂事件。獲得分辨率240000和目標(biāo)值1e6的全部掃描的MS光譜。關(guān)閉電荷態(tài)拒絕功能，電荷態(tài)設(shè)置在“未定義”，拒絕單一電

22、荷態(tài)。
　　9、生存率分析和統(tǒng)計
　　應(yīng)用一個包括1715位肺癌患者的生存信息的Kaplan-Meier生存數(shù)據(jù)庫和通過三個不同版本Affymetrix HG-U133基因芯片獲得的基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析。這個數(shù)據(jù)庫包括兩種不同的mdig探針組probes213188_s_at and213189_at。213188_s_at探針組被排除是因為它檢測mdig mRNA3'-UTR的遠(yuǎn)端和β-γ-crystallin doma

23、in containing3(CRYBG) mRNA3'-UTR的反義。應(yīng)用在本實驗生存分析的探針組213189_at是檢測mdig mRNA的open-reading frame(ORF)。生存曲線結(jié)果高表達(dá)mdig(mdighigh)和低表達(dá)mdig(mdiglow)P值＜0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)差異。生存數(shù)據(jù)用最佳閾值作為截點(diǎn)。
　　10、統(tǒng)計學(xué)分析
　　所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)((x)±s)差表示，采用SPSS13.0統(tǒng)

24、計軟件分析，組間比較采用t檢驗，相關(guān)性分析采用pearson檢驗，P＜0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1、實驗一
　　(1)短暫轉(zhuǎn)染mdig-GFP質(zhì)粒的免疫熒光結(jié)果顯示mdig分布在細(xì)胞核仁中，mdig和核仁蛋白在細(xì)胞核仁中共存。一些穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，mdig分布在細(xì)胞核基質(zhì)和細(xì)胞漿中，在細(xì)胞分裂間期，內(nèi)源性mdig分布在細(xì)胞核仁，在細(xì)胞分裂中期和后期，分布在細(xì)胞分裂紡錘體中。
　　(2) RT-PC

25、R顯示在A549細(xì)胞中，As3+誘導(dǎo)mdig mRNA增加。經(jīng)過As3+處理后，免疫熒光染色可見mdig在細(xì)胞漿內(nèi)分布。大部分斑點(diǎn)狀mdig染色信號與壓力顆粒不重合，說明那些胞漿內(nèi)的mdig的表達(dá)斑點(diǎn)，不屬于細(xì)胞壓力顆粒。
　　(3) Western blotting結(jié)果顯示穩(wěn)定轉(zhuǎn)染mdig-GFP或者沉默mdig表達(dá)的shRNA-RFP的細(xì)胞內(nèi)源性和外源性mdig的表達(dá)水平。細(xì)胞增殖實驗結(jié)果顯示五個過表達(dá)mdig穩(wěn)定克隆均促進(jìn)細(xì)

26、胞增殖。通過針對mdig mRNA兩個不同區(qū)域的shRNA沉默mdig表達(dá)均抑制細(xì)胞增殖。
　　(4)轉(zhuǎn)移實驗顯示過表達(dá)mdig的穩(wěn)定細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力減弱，而沉默mdig的細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)。侵襲實驗顯示過表達(dá)mdig的穩(wěn)定細(xì)胞侵襲能力減弱，而沉默mdig的細(xì)胞侵襲能力增強(qiáng)。通過刪除Jmjc結(jié)構(gòu)域沉默mdig表達(dá)影響了BEAS-2B細(xì)胞的形態(tài)。
　　(5)高水平的mdig對整體肺癌患者預(yù)示著較差的預(yù)后。對于沒有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者(A

27、JCC N0)和可能有臨近淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌患者(AJCC N1)，高水平的mdig預(yù)示著較差的預(yù)后。對于有遠(yuǎn)處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌患者(AJCC N2)，高水平的mdig不能預(yù)測較差的預(yù)后。
　　2、實驗二
　　(1)表達(dá)mdig-GFP的細(xì)胞DAPI染色減弱，表達(dá)高水平內(nèi)源性mdig的細(xì)胞顯示DAPI染色減弱。隨機(jī)選擇的低倍鏡視野中顯示GFP信號與DAPI染色信號的強(qiáng)度呈負(fù)相關(guān)。弱DAPI染色表達(dá)mdig-GFP的細(xì)胞數(shù)顯著大

28、于正?；驈?qiáng)DAPI染色表達(dá)mdig-GFP的細(xì)胞數(shù)。在高倍放大中，表達(dá)mdig被證實通過減少強(qiáng)DAPI染色的簇集和H3k9me3簇集數(shù)目，減少異染色質(zhì)簇集。
　　(2) mdig shRNA轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞沉默mdig的穩(wěn)定細(xì)胞系中，僅觀察到臨界的H3K9me3和H3K9me1增加，對H3K27的甲基化狀態(tài)沒有觀察到明顯的作用。siRNA在沉默mdig的細(xì)胞中，仍然僅檢測到臨界的H3K9me3增加，對H3K27me3、H3k4me

29、3、H4k20me3的甲基化狀態(tài)沒有觀察到明顯的作用。所有的三個穩(wěn)定表達(dá)mdig的克隆跟穩(wěn)定表達(dá)空載體的克隆相比，H3K9me3都有不同程度的減少，過表達(dá)mdig對H3K27me3、H3K36me3和H3K4me3沒觀察到明確的作用。免疫熒光染色在穩(wěn)定表達(dá)mdig shRNA的細(xì)胞中，H3K9me3也顯示出臨界的增加。
　　(3)定量RT-PCR顯示mdig過表達(dá)增加了正常被異染色質(zhì)結(jié)構(gòu)抑制的H19，IGF2和大衛(wèi)星X56的表達(dá)，

30、mdig上調(diào)c-Myc和Jhdm3a的表達(dá)，通過shRNA沉默mdig抑制H19的表達(dá)。染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)實驗顯示mdig過表達(dá)減少H19基因啟動子區(qū)域的H3K9me3的量。通過shRNA沉默mdig增加了H19基因啟動子和ICR區(qū)域中H3K9me3的量。
　　(4)質(zhì)譜(MS)圖顯示mdig對H3K9me3有去甲基化作用。免疫沉淀物mdig蛋白對底物組蛋白H3肽鏈的去甲基化活性的定量研究顯示mdig能移除一個、兩個、三個

31、甲基原子團(tuán)，具有從H3K9me3移除三個甲基原子團(tuán)的最強(qiáng)能力。
　　(5) Kaplan-Meier點(diǎn)狀圖顯示吸煙或者既往吸煙和高表達(dá)mdig mRNA的肺癌患者預(yù)后較差。H19的高水平表達(dá)與肺癌患者較差的生存期相關(guān)。高水平的mdig與無復(fù)發(fā)生存期較差的乳腺癌和無進(jìn)展生存期較差的卵巢癌患者相關(guān)。
　　結(jié)論：
　　1、實驗一
　　(1) mdig主要分布在細(xì)胞核仁，也可以分布在細(xì)胞核基質(zhì)和細(xì)胞漿中。
　　(2

32、)致癌物質(zhì)亞砷酸鈉(As3+)作為應(yīng)激原能誘導(dǎo)A549細(xì)胞中mdig的表達(dá)增加，同時增加mdig的胞漿內(nèi)分布。
　　(3) mdig促進(jìn)細(xì)胞增殖。過表達(dá)mdig促進(jìn)細(xì)胞增殖，沉默mdig抑制細(xì)胞增殖。
　　(4) mdig抑制細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力。過表達(dá)mdig細(xì)胞的轉(zhuǎn)移侵襲能力降低，而沉默mdig的細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲能力增強(qiáng)。
　　(5)臨床上，mdig的表達(dá)增加對有遠(yuǎn)處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌患者(AJCCN2)較好的預(yù)后，有一

33、定的預(yù)測作用。
　　2、實驗二
　　(1)表達(dá)mdig減弱細(xì)胞核異染色質(zhì)染色，使DAPI染色中異染色質(zhì)簇集，H3K9me3染色簇集消失。
　　(2) Mdig對總H3k9me3起臨界的去甲基化作用，未見對其他的組蛋白有去甲基化作用。
　　(3) Mdig能提高異染色質(zhì)區(qū)沉默的H19基因和IGF2基因的轉(zhuǎn)錄水平及衛(wèi)星DNAX56的轉(zhuǎn)錄水平，沉默mdig能抑制H19基因的轉(zhuǎn)錄，與mdig去甲基化H19基因的啟動子和I