紅笛鯛CD40基因克隆、表達及功能分析.pdf

1、紅笛鯛（Lutjanus sanguineus）是我國及東南亞重要的海水經(jīng)濟魚類，食用價值和經(jīng)濟價值極高。近年來，隨著養(yǎng)殖密度的增加及養(yǎng)殖水體的惡化，導致多種病原菌的爆發(fā)，對紅笛鯛養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。CD40分子是腫瘤壞死因子受體（tumor necrosis factor receptor, TNFR）超家族成員，屬于I型跨膜糖蛋白。CD40分子在B細胞的活化、分化、Ig的分泌及類型轉換，T細胞的激發(fā)、定向分化，抗原呈遞細胞的

2、激發(fā)、分化及功能調(diào)節(jié)，以及參與信號傳導等方面起關鍵作用。而CD40分子執(zhí)行生物學效應的前提條件是，通過CD40與CD40配體（CD40L）結合后組成的共刺激途徑來影響免疫應答。CD40與 CD40L是體內(nèi)炎癥和免疫反應系統(tǒng)的一對共刺激因子，參與機體內(nèi)的體液和細胞免疫反應。目前，對CD40基因在免疫系統(tǒng)應答中的作用研究主要集中在哺乳動物，在硬骨魚中極為鮮見。為了研究外界病原菌感染紅笛鯛過程中，CD40基因在宿主免疫應答系統(tǒng)中的作用機制，我

3、們開展了紅笛鯛非特異性免疫基因CD40的分子克隆、表達特征及功能研究。
　　1.通過同源克隆及RACE技術，從紅笛鯛頭腎組織中成功克隆了CD40基因的cDNA全長，通過生物信息學軟件分析，結果表明，紅笛鯛CD40 cDNA序列由2073個核苷酸組成，完整開放閱讀框（ORF）為984 bp，5?非編碼區(qū)（5?-UTR）為69 bp，3?非編碼區(qū)（3?-UTR）為1020 bp，編碼327個氨基酸，預測分子量（MW）為36.28 KD

4、a，理論等電點（pI）為5.38。N端有30 aa的信號肽序列，在200-222 aa位置存在跨膜結構域。紅笛鯛CD40基因比較保守，具有TNFR家族成員共有的半胱氨酸富含域。構建系統(tǒng)進化樹分析顯示：紅笛鯛與點帶石斑魚（Epinephelus malabaricus）的親緣關系較近。
　　2.利用半定量RT-PCR技術對紅笛鯛CD40基因的組織分布狀況進行分析，結果顯示，CD40基因在紅笛鯛各組織中均有表達，其中在脾臟、頭腎、肝臟

5、、鰓、腦、心臟、胃中表達量較高，而胸腺、肌肉、腸、皮膚中表達量較少。應用Real-Time PCR檢測在哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）、poly I:C、LPS分別刺激紅笛鯛和紅笛鯛頭腎細胞后，不同時間內(nèi)CD40基因的表達變化。結果顯示，紅笛鯛分別經(jīng)哈維氏弧菌、poly I:C刺激后，CD40在頭腎、胸腺、脾臟、肝臟、腸、鰓、肌肉組織中的表達量均上調(diào)且表達模式相似。0~84 h內(nèi)，隨免疫時間的延長，CD40基因的表達量在上述

6、組織中達到峰值的時間不同。Poly I:C、LPS刺激紅笛鯛頭腎白細胞后，結果顯示，CD40基因在細胞中表達量上調(diào)，在孵育細胞12 h后達到峰值，且經(jīng)LPS孵育后CD40的表達量高于poly I:C的孵育結果。
　　3.構建原核表達重組質(zhì)粒pET32-CD40、pET32-△CD40和pET32-△△CD40，分別表達CD40基因全長cDNA、去信號肽基因cDNA片段和胞外段基因cDNA片段，通過優(yōu)化表達體系，三個重組融合蛋白的最

7、優(yōu)表達條件分別是：37℃下，0.08 mmol.L-1 IPTG，OD600=0.4，誘導5 h；37℃下，0.1 mmol.L-1 IPTG，OD600=0.6，誘導6 h；37℃下，0.06 mmol.L-1 IPTG，OD600=0.6，誘導6 h。均以包涵體形式存在。對pET32-△△CD40重組蛋白進行純化，Western blot分析發(fā)現(xiàn)CD40胞外段融合蛋白能夠與鼠抗His-Tag單克隆抗體發(fā)生特異性結合，表明目的蛋白得以

8、成功表達。通過對重組載體pET32-CD40、pET32-△CD40分別在最優(yōu)條件誘導后發(fā)現(xiàn)，pET32-△CD40的表達量高于pET32-CD40。
　　4.用純化后的pET32-△△CD40重組蛋白，免疫小鼠，制備了高效特異的鼠抗紅笛鯛CD40多克隆抗體。同時利用制備的多克隆抗體對紅笛鯛胸腺、頭腎及脾臟組織進行了免疫組織化學分析。結果顯示，CD40主要分布于上述器官的淋巴細胞中。采用CD40抗血清進行體外抗體中和實驗，結果表明