晚期糖基化終產(chǎn)物單克隆抗體的制備.pdf

1、研究目的：為建立檢測血清中晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)濃度的微量測定技術(shù)，為糖尿病慢性并發(fā)癥的診斷、治療及預(yù)后評估提供依據(jù)，本研究試圖制備抗人AGEs單克隆抗體。 研究方法：D-葡萄糖和人血清白蛋白(HSA)溶解于磷酸鹽緩沖液(PBS)中，37℃恒溫孵育12周，同時以不含D-葡萄糖的HSA為對照。12周后透析凝膠過濾純化，熒光測定、蛋白定量及聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳鑒定。取100μg純化后的第一峰AGE-HS

2、A加等體積福氏佐劑免疫Babl/c小鼠，共3次，用聚乙二醇(PEG)行細(xì)胞融合，用雜交瘤細(xì)胞選擇性培養(yǎng)基次黃嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷(HAT)及次黃嘌呤、胸腺嘧啶核苷(HT)選擇性培養(yǎng)，間接酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)篩選培養(yǎng)上清，包被的抗原為純化后的第一峰AGE-HSA，選擇對AGEs陽性，對HSA陰性的多克隆孔進行亞克隆，間接ELISA篩選亞克隆板孔的細(xì)胞培養(yǎng)上清。收集陽性單克隆細(xì)胞株，注射Babl/c小鼠制備腹水，經(jīng)固相化甘

3、露聚糖結(jié)合蛋白(MBP)柱純化腹水。行亞型鑒定，并通過間接ELISA、westernblot對抗體行特異性鑒定，并進行染色體鑒定。 結(jié)果：D-葡萄糖和HSA孵育12周后，反應(yīng)液呈棕色，SDS-PAGE示分子量大于HSA的葡萄糖-HSA偶聯(lián)產(chǎn)物，熒光測定表明產(chǎn)物系A(chǔ)GEs。經(jīng)SephadexG-200純化后，得到高分子量和低分子量的兩個蛋白峰，分別稱為第一峰和第二峰。第一峰作為免疫原，免疫Babl/c小鼠后血清滴度大于1：106，