小鼠胎肝間充質細胞和Sca-1~+細胞體內外向肌樣細胞分化的實驗研究.pdf

1、　　目的：探討小鼠胎肝間充質和Sca-1~+細胞在體內外向肌樣細胞分化的潛能。
　　方法：體外無菌條件下獲取胎齡14.5d的小鼠胎肝,制成單細胞懸液,貼壁培養(yǎng)并傳代,第三代傳代細胞用10μmol/15-氮胞苷與1mg/1二性霉素B誘導24h,誘導處理后置于完全培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng),不同時間點用半定量RT-PCR法檢測骨骼肌細胞相關基因Myf5,Myogenin的mRNA表達情況,培養(yǎng)后7d和14d,用免疫細胞化學鑒定骨骼肌細胞特異性抗

2、原Desmin、α-Actin的表達情況。體內實驗按8μg/g體重將Cardiotoxin局部注射入左側股四頭肌,造成雌鼠骨骼肌損傷模型,24h后將純化的雄性胎肝間充質細胞按1×10~6/只小鼠注射至股四頭肌,無菌環(huán)境下飼養(yǎng)2月后,處死小鼠,制備受體小鼠骨骼肌組織切片,用免疫組織化學染色對骨骼肌細胞進行特異性標記,再進一步用熒光標記的Y染色體探針進行熒光原位雜交(FISH)檢測雌性受體小鼠骨骼肌組織內供體小鼠胎肝間充質細胞向骨骼肌細胞分

3、化情況。
　　性別鑒定為雄性的胎肝單細胞懸液經MASC分離得到Sca-1~+細胞,2×10~3個Sca-1~+細胞經尾靜脈移植進10Gy照射的同系雌鼠體內,2月后處死小鼠,制備受體小鼠骨骼肌、心肌組織切片,用免疫組織化學染色分別對骨骼肌細胞、心肌進行特異性標記,再進一步用熒光標記的Y染色體探針進行熒光原位雜交(FISH),檢測雌性受體小鼠骨骼肌組織、心肌組織內供體小鼠胎肝Sca-1~+細胞分別向骨骼肌和心肌細胞的分化情況。

4、　　結果：第三代胎肝間充質細胞經5-氮胞苷與二性霉素B誘導處理后,細胞形態(tài)改變出現(xiàn)骨骼肌樣細胞。半定量RT-PCR結果顯示誘導分化后的骨骼肌細胞相關基因Myf5,Myogenin的mRNA隨時間序貫表達。免疫細胞化學顯示誘導分化后的細胞有骨骼肌特異性蛋白如Desmin、α-Actin的表達,且隨培養(yǎng)時間的延長陽性率升高,未誘導組的細胞形態(tài)未發(fā)生明顯變化,骨骼肌特異性蛋白表達陰性。胎肝間充質細胞體內局部注射后2月,在骨骼肌組織內發(fā)現(xiàn)存在Y